Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1. A ZUSAMMENFASSUNG 1
1. B SUMMARY 3
2. EINLEITUNG 5
2.1. DER GENUS
STAPHYLOCOCCUS.5
2.2. INFEKTIONEN DURCH KOAGULASE-NEGATIVE STAPHYLOKOKKEN.5
2.3. ANTIBIOTIKARESISISTENZ BEI STAPHYLOKOKKEN.6
2.4. ADHAERENZ UND BIOFILMBILDUNG BEI
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS.6
2.5. PHASENVARIATION UND PHAENOTYPVARIABILITAET.9
2.6. MOBILE GENETISCHE ELEMENTE.10
2.6.1. TRANSPOSITIONSMECHANISMEN.11
2.6.2. DAS INSERTIONSELEMENT IS256.14
3. MATERIAL 16
3.1. VERBRAUCHSMATERIALIEN.16
3.1.1. CHEMIKALIEN.16
3.1.2. ENZYME.16
3.1.3. ANTIBIOTIKA.16
3.2. BAKTERIENKULTUR.17
3.2.1. BAKTERIENSTAEMME.17
3.2.2. MEDIEN ZUR BAKTERIENKULTUR.17
3.3. NUKLEOTIDE UND OLIGONUKLEOTIDE.19
3.3.1. NUKLEOTIDE.19
3.3.2. OLIGONUKLEOTIDE.19
3.4. PLASMIDE UND VEKTOREN.20
3.5. PUFFER UND LOESUNGEN.21
3.6. GERAETE.22
4. METHODEN 24
4.1. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI UND STAPHYLOKOKKEN.24
4.1.1. MINIPRAEPARATION- PLASMIDISOLIERUNG IM KLEINEN MASSSTAB AUS E.
COLI.24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.1.2. MIDIPRAEPARATION- PLASMIDISOLIERUNG IM MITTLEREN MASSSTAB AUS
E. COLI.24
4.1.3. PLASMIDISOLIERUNG AUS
STAPHYLOCOCCUS SPP.: MINIPRAEPARATION (UND
MIDIPRAEPARATION).25
4.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN UND DNA.25
4.3. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).25
4.4. INVERSE PCR.27
4.5. REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN.27
4.6. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN IM
AGAROSESEGEL.27
4.7. EXTRAKTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.28
4.8. RESTRIKTION VON DNA. 28
4.9. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.29
4.10. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.29
4.11. TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN E. COLI UND STAPHYLOKOKKEN.30
4.11.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER
E. COLI-ZELLEN.30
4.11.2. HERSTELLUNG KOMPETENTER
STAPHYLOCOCCUS AUREUS-ZEWEN.30
4.11.3. TRANSFORMATION VON
E. COLI-ZELLEN (CACL
2
-METHODE).30
4.11.4. TRANSFORMATION VON
STAPHYLOCOCCUS AUREUS (ELEKTROPORATION).31
4.12. PGEM-T-EASY VEKTOR SYSTEM.31
4.13. ISOLIERUNG VON CHROMOSOMALER DNA AUS STAPHYLOKOKKEN.31
4.14. PHENOLEXTRAKTION.32
4.15. ETHANOLFAELLUNG.32
4.16. SOUTHERN-BLOT-ANALYSE.32
4.16.1. KAPILLARBLOT AUF EINE NYLONMEMBRAN.33
4.16.2. VAKUUMBLOT AUF EINE NYLONMEMBRAN.33
4.16.3. DOT-BLOT.
34
4.16.4. NICHTRADIOAKTIVE MARKIERUNG VON SONDEN MIT DEM ECL-SYSTEM.34
4.16.5 HYBRIDISIERUNG, WASCHEN UND ENTWICKLUNG DES BLOTS.34
4.17. SEQUENZIERUNG.35
4.17.1. SEQUENZIERUNG MIT DEM LICOR-SEQUENZIERER VON MWG.35
4.17.2. SEQUENZIERUNG MIT DEM ABI-SEQUENZIERER VON PERKIN-ELMER.36
4.18. PFGE-PULSFELDGELELEKTROPHORESE (WECHSELFELDGELELEKTROPHORESE).37
4.19. BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION VON ANTIBIOTIKA
(MHK).39
4.20. AGARDIFFUSIONSTEST.
4.21. SPEZIESBESTIMMUNG MIT DEM API-STAPH-SYSTEM.40
4.22. ADHAERENZASSAY.40
4.23. ERSTELLUNG VON WACHSTUMSKURVEN.40
4.24. BESTIMMUNG DER VARIATIONSRATE VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS.41
4.25. ERSTELLUNG EINER COSMID-GENBANK.41
4.25.1. PRAEPARATION DER VEKTOR-DNA.42
4.25.2. PRAEPARATION DER GENOMISCHEN DNA.42
4.25.3. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN IN DEN COSMID-VEKTOR SUPERCOSL.43
4.25.4. YYPACKAGING": VERPACKEN DER COSMIDE IN PHAGENPARTIKEL.43
4.25.5. PHAGENTRANSDUKTION IN
E. CO/I-WIRTSZELLEN.44
5. ERGEBNISSE 45
5.1. VARIATIONEN IN DER PRODUKTION DES POLYSACCHARID-INTERZELLULAEREN
ADHAESINS BEI
NACHKOMMEN EINES KLINISCHEN STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ISOLATS.45
5.1.1. BESTIMMUNG DER VARIATIONSRATE DER PIA-PRODUKTION.45
5.1.2. PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS-VARIANTEN.47
5.1.2.1. BETRACHTUNG DER KOLONIEMORPHOLOGIE AUF KONGOROTAGARPLATTEN.47
5.1.2.2. DURCHFUEHRUNG VON ADHAERENZASSAYS MIT ROTEN STAPHYLOCOCCUS 48
EPIDERMIDIS KOLONIEN.48
5.1.3. GENOTYPISCHE ANALYSE DER
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS-VARIANTEN.48
5.1.3.1. AUSSCHLUSS VON KONTAMINATIONEN UND NACHWEIS VON REARRANGEMENTS
DURCH PULSFELDGELEKTROPHORESE. 49
5.1.3.2. ICAK- UND I'CAC-SPEZIFISCHE PCR UND SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG.50
5.1.3.3. IS25D-HYBRIDISIERUNGSMUSTER VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307
UND DESSEN VARIANTEN.52
5.2. CHARAKTERISIERUNG DER DELETIONSMUTANTEN
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/9 UND
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/56.55
5.2.1. PHAENOTYPISCHE TESTS.55
5.2.1.1. WACHSTUMSVERHALTEN VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/9 IM
VERGLEICH ZUM WILDTYP STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307.55
5.2.1.2. DURCHFUEHRUNG EINES API-STAPH-TESTS.57
5.2.1.3. BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION VON GENTAMICIN BEI
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
307 UND STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/9. 57
5.2.1.4. AGARDIFFUSIONSTEST ZUR ERMITTLUNG DES RESISTENZPROFILS VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/9 UND 307/56.58
5.2.2. UNTERSUCHUNG DES DELETIERTEN BEREICHS VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/9. 59
5.2.2.1. ERSTELLUNG EINER COSMID-GENBANK VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
307. 60
5.2.2.2. SEQUENZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON TEILEN DES DELETIERTEN
BEREICHS.60
5.2.2.3. IS256-INSERTION IM GENOM DES WILDTYPSTAMMES STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS 307.63
5.2.2.4. VERGLEICH DER SEQUENZ VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307 MIT
DEM
SEQUENZBEREICH VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS RP62A.64
5.2.2.5. SHOT-GUN KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES DELETIONSRANDBEREICHS
VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
307/9.65
5.2.3. UNTERSUCHUNG DES DELETIERTEN BEREICHS VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
307/56: AMPLIFIKATION MITTELS INVERSER PCR UND SEQUENZIERUNG.69
5.2.3. WEITERE DELETIONSMUTANTEN VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307
5.3. CHARAKTERISIERUNG DER IS256-INSERTIONSMUTANTEN DES STAMMES
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307.
5.3.1. ANZAHL UND HYBRIDISIERUNGSMUSTER DES IS256-ELEMENTS BEI
INSERTIONSMUTANTEN VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307.
5.3.2. SEQUENZIERUNG DER IS256-INSERTIONSSTELLEN IM ICA-OPERON.
5.4. UNTERSUCHUNGEN ZUM TRANSPOSITIONSMECHANISMUS DES INSERTIONSELEMENTS
IS256.77
5.4.1. IDENTIFIZIERUNG VON ZIRKULAEREN IS256-MOLEKUELEN IN
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
307 UND STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307/95.77
5.4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR BILDUNG VON ZIRKULAEREN IS256-MOLEKUELEN IN
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS UND ESCHERICHIA COLI.
5.4.3. KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER AMPLIFIZIERTEN ZIRKULAEREN
IS256-MOLEKUELE.80
5.4.4. IDENTIFIZIERUNG VON ZIRKULAEREN IS25(5-MOLEKUELEN MITTELS
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE . 83
5.4.5. EINFUEHRUNG EINER MUTATION IN DAS PUTATIVE IS2J6-TRANSPOSASEGEN.84
6. DISKUSSION
6.1. DIE BIOFILMBILDUNG BEI
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS IST VARIABEL.
6.1.1. GENOTYPISCHE VARIABILITAET BEI
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 307: NACHWEIS VON
GENOMISCHEN UMORDNUNGEN DURCH DNA-FINGERPRINTS UND IS256-SPEZIFISCHE
HYBRIDISIERUNGEN.
6.1.2. IS256-INSERTIONEN IM ICA-OPERON VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS FUEHREN ZU
EINEM PIA-NEGATIVEN PHAENOTYP.
6.1.3. DELETIONEN IM GENOM VON STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS BETREFFEN AUCH
DAS ICA-
OPERON
.
6.2. DIE BILDUNG VON ZIRKULAEREN IS256-MOLEKUELEN ALS MOEGLICHES
ZWISCHENPRODUKT IN
DER TRANSPOSITIONSREAKTION.
6.2.1. DIE VON IS256 KODIERTE TRANSPOSASE VERMITTELT DIE BILDUNG VON
ZIRKULAEREN
.
6.2.2. MODELLE FUER DIE BILDUNG DER ZIRKULAEREN IS256-MOLEKUELE.
6.2.3. DER EINFLUSS DER IS256-TRANSPOSITION AUF DIE GENOMPLASTIZITAET VON
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS.^
6.3. DIE BEDEUTUNG VON MOBILEN GENETISCHEN ELEMENTEN FUER DIE
GENOMEVOLUTION.102
7. LITERATURVERZEICHNIS 106
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.120
ANHANG I: SEQUENZDATEN DER S. EPIDERMIDIS 307 COSMID-KLONE.122
ANHANG II: SEQUENZBEREICH AUS
S. EPIDERMIDIS RP62A.139
ANHANG III: SEQUENZ DES DELETIONSRANDBEREICHS VON
S. EPIDERMIDIS 307/56.147 |
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