Identifizierung regulatorischer Bereiche im E1B-55kDa Protein von Adenovirus Serotyp 5 und ihre Rolle bei der Transformation:
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Regensburg
2002
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I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
./
ABKUERZUNGEN
.
IV
1 EINLEITUNG
.
1
1.1 TRANSFORMATION DURCH TUMORVIREN.1
1.1.1 TRANSFORMATION UND TUMORBILDUNG.1
1.1.2 ONKOGENE VIREN DES MENSCHEN.1
1.2 ADENOVIREN.3
1.2.1 ONKOGENES POTENTIAL DER HUMANEN ADENOVIREN.3
1.2.2 GENOMORGANISATION UND PRODUKTIVER REPLIKATIONSZYKLUS HUMANER
ADENOVIREN.5
1.2.3 DIE ROLLE DER EL-PROTEINE VON AD5 BEI DER TRANSFORMATION.8
1.2.3.1 DIE EIA-PROTEINE
.8
1.2.3.2 ELB-L9KDA.^-.11
1.2.3.3 ELB-55KDA. 12
1.3 POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATION DURCH SUMO-1.17
1.3.1 SUMO UND SUMO-SPEZIFISCHE ENZYME.17
1.3.2 ZIELPROTEINE UND MOEGLICHE FUNKTIONEN DER SUMO-1-MODIFIKATION.21
1.3.2.1 ZELLULAERE SUBSTRATPROTEINE.21
1.3.2.2 VIRALE SUBSTRATPROTEINE
.I.24
1.4 AUFGABENSTELLUNG.26
2 MATERIAL
.
27
2.1 ZELLEN.27
2.1.1 SAEUGERZELLINIEN.27
2.1.2 BAKTERIENSTAEMME.28
2.1.3 VIREN.28
2.2 NUKLEINSAEUREN.29
2.2.1 OLIGONUKLEOTIDE.29
2.2.2 PLASMIDE.30
2.3 ENZYME, REAGENTIEN UND NACHWEISSYSTEME.31
2.4 ANTIKOERPER.32
2.4.1 PRIMAERANTIKOERPER. 32
2.4.2 SEKUNDAERANTIKOERPER.33
2.5 HAEUFIG VERWENDETE PUFFER.34
2.6 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL.34
2.7 GROEBEN- UND MOLEKULARGEWICHTSMARKER.35
2.8 COMPUTERPROGRAMME UND DATENBANKEN.35
3 METHODEN
.
57
3.1 BAKTERIEN.37
3.1.1 KULTURBEDINGUNGEN UND LAGERUNG.37
3.1.1.1 PLATTENKULTUREN.37
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
3.1.1.2 FLUESSIGKULTUREN
.37
3.1.1.3 GLYCERINKULTUREN.37
3.1.2 TRANSFORMATION VON E. COLI NACH DER RUBIDIUMCHLORID-METHODE.38
3.1.3 TRANSFORMATION VON E. COLI DURCH ELEKTROPORATION.40
3.2 GEWEBEKULTUR.41
3.2.1 VERMEHRUNG UND AUFBEWAHRUNG VON ZELLEN.41
3.2.1.1 KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN ALS EINSCHICHTKULTUR.41
3.2.1.2 GEWINNUNG UND KULTIVIERUNG PRIMAERER RATTENNIERENZELLEN.41
3.2.1.3 LAGERUNG VON SAEUGERZELLEN
.42
3.2.2 BESTIMMUNG DER GESAMT-ZELLZAHL.42
3.2.3 TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN.'.42
3.2.4 ETABLIERUNG VON ZELLINIEN AUS TRANSFORMIERTEN RATTENZELLEN.43
3.2.5 INFEKTION VON SAEUGERZELLEN MIT ADENOVIREN.44
3.2.6 ERNTE UND AUFSCHLUSS VON ZELLEN.44
3.2.6.1 ERNTE VON SAEUGERZELLEN
.44
3.2.6.2 AUFSCHLUSS VON SAEUGERZELLEN.45
3.3 ADENOVIREN.45
3.3.1 TITERBESTIMMUNG VON VIRUSSTOCKS.45
3.3.2 ISOLIERUNG VON VIREN AUS DER ZELLKULTUR.46
3.4 PROTEIN.,.~.46
3.4.1 QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG IM BLORAD PROTEIN-ASSAY.46
3.4.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).46
3.4.3 WESTERN BLOT.48
3.4.4 IMMUNPRAEZIPITATION.49
3.4.5 IMMUNFLUORESZENZ.51
3.4.6 REPORTER-ZL.S.SAY.51
3.5 DNA.53
3.5.1 SYNTHESE UND REINIGUNG SYNTHETISCHER OLIGONUKLEOTIDE.53
3.5.2 PRAEPARATION, REINIGUNG UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.54
3.5.2.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS E. COLI.54
3.5.2.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.54
3.5.2.3 PRAEPARATION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.55
3.5.2.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.56
3.5.3 RESTRIKTIONSENZYM-SPALTUNG VON DNA.57
3.5.3.1 ANALYTISCHE SPALTUNG ZUR CHARAKTERISIERUNG VON PLASMIDEN.57
3.5.3.2 PRAEPARATIVE SPALTUNG FUER KLONIERUNGEN.57
3.5.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).57
3.5.4.1 STANDARD PCR-ANSATZ.57
3.5.4.2 EINFUHREN VON MUTATIONEN DURCH PCR.58
3.5.5 LIGATION.58
3.5.6 IDENTIFIKATION REKOMBINANTER KLONE.59
3.5.7 DNA-SEQUENZIERUNG.59
4 ERGEBNISSE
.
61
4.1 SUMO-1-MODIFIKATION VON AD5 E1B-55KDA.61
4.1.1 IDENTIFIZIERUNG EINER SUMO-1-KONSENSUSSEQUENZ IM ELB-55KDA-PROTEIN
VON AD5.61
4.1.2 AD5 ELB-55KDA WIRD IN VIVO AN POSITION 104 DURCH SUMO-1
MODIFIZIERT.61
4.1.3 SUMO-2- UND SUMO-3-MODIFIKATION VON AD5 ELB-55KDA.64
4.2 DIE ROLLE DER SUMO-1-MODIFIKATION BEI DER
EL A/E1B-55KDA-VERMITTELTEN
TRANSFORMATION.66
4.2.1 VERLUST DER TRANSFORMIERENDEN EIGENSCHAFTEN VON AD5 EL B-55KDA
DURCH MUTATION DER SUMO-1-
AKZEPTORSEQUENZ.66
4.2.2 K104R-MUTATION DER SUMO-1-AKZEPTORREGION VON AD5 ELB-55KDA
BEEINFLUSST NICHT DIE
INTERAKTION MIT P53.68
4.2.3 SUMO-1-KONJUGATION VON AD5 EL B-55KDA IST NOTWENDIG FUER DIE
INHIBITION DER P53
TRANSAKTIVIERUNG.69
III
4.3 EINFLUB DER SUMO-1-KONJUGATION AUF DIE SUBZELLULAERE LOKALISATION VON
AD5 E1B-55KDA.72
4.3.1 LOKALISATION VON AD5 ELB-55KDA UND SUMO-1 IN TRANSFORMIERTEN
RATTENZELLEN.72
4.3.2 EINFLUSS DER SUMO-1-MODIFIKATION AUF DIE PENDELAKTIVITAET VON AD5
ELB-55KDA.74
4.4
ROLLE DES NES VON AD5 E1B-55KDA UND DER SUMO-1-KONSENSUSSEQUENZ VON
AD12 E1B-54KDA IN DER TRANSFORMATION.76
4.4.1 AMINOTERMINALER SEQUENZVERGLEICH VON AD5 ELB-55KDA UND ADL2
ELB-54KDA.76
4.4.2 VERIFIZIERUNG DER PENDELAKTIVITAET VON AD5 ELB-55KDA IN
TRANSFIZIERTEN RATTENZELLEN.77
4.4.3 AD5 E1B-NES, NICHT ABER AD 12 ELB-54KDA, WIRD
IN VIVO DURCH SUMO-1 MODIFIZIERT.80
4.4.4 DIE INHIBITION DES NUKLEAEREN EXPORTS VON ELB-55KDA VERRINGERT
NICHT SEIN KOOPERATIVES
TRANSFORMIERENDES POTENTIAL.82
4.4.5 POTENTIELLE SUMO-1-KONSENSUSMOTIVE VON ADL2 ELB-54KDA SPIELEN
KEINE ROLLE BEI DER EL A-
GEKOPPELTEN TRANSFORMATION.84
4.4.6 INTERAKTION VON E1B-NES UND E1B-K104R-NES MIT P53.86
4.4.7 NUKLEAERE RETENTION VON AD5 ELB-55KDA VERSTAERKT DIE INHIBITION DER
P53 TRANSAKTIVIERUNG.87
4.4.8 POTENTIELLE SUMO-1-KONSENSUSMOTIVE VON AD 12 ELB-54KDA SPIELEN
KEINE ROLLE BEI INHIBITION
DER P53-TRANSAKTIVIERUNG.90
4.5 INTRANUKLEAERE PROTEINKOMPLEXE ALS DURCHGANGSSTATIONEN WAEHREND DER
PENDELAKTIVITAET VON AD5 E1B-55KDA.91
4.5.1 INTRANUKLEAERE AKKUMULATION VON ELB-55KDA UND P53 BEI INHIBIERUNG
DES NUKLEAEREN EXPORTS. 91
4.5.2 PODS ALS TRANSIENTE AUFENTHALTSSTATIONEN WAEHREND DER
PENDELAKTIVITAET VON AD5 ELB-55KDA.94
5
DISKUSSION.
98
5.1 POSTTRANSLATION ALE MODIFIKATION VON AD5 E1B-55KDA
IN
VIVO.98
5.2 DAS TRANSFORMIERENDE POTENTIAL DER GROBEN EIB-PROTEINE VON AD5 UND
AD12.100
5.2.1 AD5 ELB-55KDA.100
5.2.2 AD 12 ELB-54KDA.105
5.3 DIE SUBZELLULAERE LOKALISATION VON AD5 E1B-55KDA.107
5.3.1 AKKUMMULATION VON ELB-55KDA, P53 UND SUMO-1 IN SUBNUKLEAEREN
STRUKTUREN.107
5.3.2 BEDEUTUNG DER POEJ-LOKALISATION VON AD5 ELB-55KDA BEI DER
TRANSFORMATION.109
5.3.2.1 PODS-SUBNUKLEAERE PROTEINKOMPLEXE.109
5.3.2.2 PODS ALS ZIELE VIRALER PROTEINE
.110
5.3.2.3 POTENTIELLE ROLLE VON PML BEI DER AD EL-VERMITTELTEN
TRANSFORMATION.113
5.4 MODELLVORSTELLUNG.115
5.5 AUSBLICK.117
6 ZUSAMMENFASSUNG.
.
119
7 LITERA TUR VERZEICHNIS
.
121
VEROEFFENTLICHUNGEN.
.
137
DANKSAGUNG
138 |
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| spelling | Endter, Christian Verfasser aut Identifizierung regulatorischer Bereiche im E1B-55kDa Protein von Adenovirus Serotyp 5 und ihre Rolle bei der Transformation vorgelegt von Christian Endter Regensburg 2002 IV, 138 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Universität Regensburg 2002 Genregulation (DE-588)4122166-7 gnd rswk-swf Polypeptide (DE-588)4175278-8 gnd rswk-swf Adenovirus 5 (DE-588)4566151-0 gnd rswk-swf Carcinogenese (DE-588)4069853-1 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Carcinogenese (DE-588)4069853-1 s Adenovirus 5 (DE-588)4566151-0 s Polypeptide (DE-588)4175278-8 s Genregulation (DE-588)4122166-7 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-opus-967 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-opus-967 Resolving-System kostenfrei Volltext https://epub.uni-regensburg.de/9939/ Verlag kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009999854&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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