Charakterisierung der Genexpression mechanisch stimulierter Fibroblasten:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
:
.
1
1.1
DAS
BINDEGEWEBE
.
1
1.1.1
BINDEGEWEBSKOMPONENTEN
.
2
1.1.1.1
EXTRAZELLULAERE
MATRIX
.
2
1.1.1.1.1
AMORPHE
GRUNDSUBSTANZ
.
2
1.1.1.1.2
FASERPROTEINE
.
3
1.1.1.2
FIBROBLASTEN
UND
IHRE
HETEROGENITAET
.
5
1.1.1.3
REZEPTOREN
DER
EXTRAZELLULAEREN
MATRIX
.
7
1.1.1.3.1
INTEGRINE
UND
FOKALKONTAKTE
.
7
1.1.1.3.2
DISCOIDIN
DOMAIN-REZEPTOREN
(DDR)
.
9
1.1.1.4
ABBAU
DER
EXTRAZELLULAEREN
MATRIX
.
9
1.1.1.4.1
MATRIXMETALLOPROTEASEN
(MMPS)
.
9
1.1.1.4.2
PLASMINOGEN-AKTIVATOR-INHIBITOR-SYSTEM
.
10
1.2
KULTURSYSTEME
UND
MECHANOTRANSDUKTION
.
12
1.2.1
KULTURSYSTEME
.
12
1.2.2
MODELLE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
AUSWIRKUNGEN
VON
MECHANISCHEM
STRESS
AUF
ZELLEN
13
1.2.2.1
AUSWIRKUNG
VON
MECHANISCHEN
STIMULI
IN
VIVO
.
13
1.2.2.2
ZWEIDIMENSIONALE
KULTURSYSTEME
.
14
1.2.2.3
DREIDIMENSIONALE
KULTURSYSTEME
.
14
1.2.2.4
EFFEKTE
VON
MECHANISCHEN
KRAEFTEN
AUF
DAS
ZYTOSKELETT
.
16
1.3
UNTERSUCHUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
GENEXPRESSION
.
18
1.4
SKLERODERMIE
ALS
BEISPIEL
FUER
EINE
FIBROTISCHE
ERKRANKUNG
DES
BINDEGEWEBES
.
20
2
ZIELSETZUNG
.
23
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
25
3.1
MATERIAL
.
25
3.1.1
CHEMIKALIEN,
RADIOCHEMIKALIEN,
GROESSEN-
UND
GEWICHTSSTANDARDS
.
25
3.1.2
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
.
25
3.1.3
MATERIALIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
26
3.1.4
ANTIKOERPER
.
26
3.1.5
ENZYME
.
27
3.1.6
BAKTERIENSTAEMME
.
27
31.7
ZELLLINIEN
.
27
3.1.8
VEKTOREN
UND
DNA-SONDEN
.
28
3.1.9
GERAETE
.
28
3.1.10
FILMMATERIALIEN
.
29
3.2
METHODEN
.
30
3.2.1
ZELLBIOLOGIE
.
30
3.2.1.1
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
.
30
3.2.1.2
PRAEPARATION
VON
KOLLAGEN-GELEN
.
30
3.2.1
3
HERAUSLOESEN
VON
FIBROBLASTEN
AUS
KOLLAGEN-GELEN
MIT
KOLLAGENASE
.
31
3.2.1.4
FLEXERCELLYY
STRETCHING
UNIT
.
31
3.2.1.5
SERUMFREISETZUNG
UND
STIMULATION
MIT
WACHSTUMSFAKTOREN
.
32
3.2.2
IMMUNHISTOLOGISCHE
ARBEITEN
.
32
3.2.2.1
IMMUNFLUORESZENZ
AUF
HAUTSCHNITTEN
.
32
3.2.2
2
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
VON
ZELLEN
.
33
3.2.2.3
YYWHOLE
MOUNT
"
-FAERBUNG
VON
KOLLAGEN-GELEN
.
33
3.2.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
33
3.2.3.1
PROTEINFAELLUNG
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
(TCA)
.
33
3.2.3.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
34
3.2.3.3
COOMASSIE
BLUE-FAERBUNG
.
34
3.2.3.4
IMMUNOBLOT (WESTERN
BLOT-DETEKTION
VON
PROTEINEN)
.
35
3.2.3.5
NICHT-RADIOAKTIVE
IMMUNPRAEZIPITATION
.
35
3.2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
36
3.2.4.1
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
VON
NUCLEINSAEUREN
.
36
3.2.4.1.1
RNA
.
36
3.2.4.1.1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
MONOLAYERKULTUREN
.
36
3.2.4.1.1.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
KOLLAGEN-GELEN
.
36
3.2.4.1.1.3
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
HAUT
.
37
3.2.4.1.1.4
ISOLIERUNG
VON
MRNA
.
37
3.2.4.1.1.5
DENATURIERENDE
ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG
VON
RNA,
TRANSFER
AUF
EINE
NYLONMEMBRAN
UND
HYBRIDISIERUNG
MIT
DNA-SONDEN
(NORTHERN
BLOT)
.
38
3.2.4.1.1.6
ANALYSE
DER
MRNA-EXPRESSION
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN
.
39
3.2.4.1.1.7
NICHT-RADIOAKTIVE
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
.
39
3.2.4.1.2
DNA
.
40
3.2.4.1.2.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
40
3.2.4.1
2.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
UND
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
40
3.2.4.1.2.3
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
DURCH
HITZESCHOCK
.
41
3.2.4.1.2.4
TA-TOPO-CLONINGYY
SYSTEM
.
41
3.2.4.1.2.5
PLASMIDPRAEPARATIONEN
.
41
3.2.4.1.2.6
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUCLEINSAEUREN
.
42
3.2.4.1.2.7
DNA-SEQUENZANALYSE
.
42
3.2.4.1.2.8
AMPLIFIZIERUNG
VON
CDNA-ENDEN
MIT
SMART-RACE
(CLONTECH)
.
42
3.2.4.1.2.9
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
.
44
4
ERGEBNISSE
.
45
4.1
ZELLKULTURSYSTEM
.
45
4.2
DIFFERENTIELLE
GENEXPRESSION
VON
FIBROBLASTEN
IN
YYFREELY
FLOATING
LATTICES
"
UND
YYBOUND
LATTICES
"
.
48
4.2.1
CDNA-MIKROCHIPANALYSE
.
48
4.2.2
KLASSIFIZIERUNG
DER
ERGEBNISSE
.
49
4.2.3
MECHANISCH
INDUZIERTE
TRANSKRIPTE
.
50
4.2.3.1
ZELLZYKLUS-REGULATOREN
UND
PROLIFERATIONSASSOZIIERTE
GENE
.
50
4.3.3.2
DNA-SYNTHESE/-MODIFIKATION/-TRANSKRIPTION/-REPARATUR
UND
NUCELOSID
METABOLISMUS
.
51
4.2.3.3
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
UND
DNA-BINDENDE
PROTEINE
.
51
4.2.3.4
INTRAZELLULAERE
SIGNALMODULATOREN
UND
DEREN
EFFEKTOREN,
LONENKANAELE
UND
LONENTRANSPORTER
.
54
4.2.3.5
REZEPTOREN
UND
ZELLOBERFLAECHENANTIGENE
.
55
4.2.3.6
ZYTOKINE,
WACHSTUMSFAKTOREN,
CHEMOKINE
.
56
4.2.3.7
BESTANDTEILE
DES
ZYTOSKELETTS,
DER
FOKALKONTAKTE
UND
DER
EXTRAZELLULAEREN
MATRIX.
57
4.2.3.8
PROTEASE-INHIBITOREN
.
58
4.2.4
IN
FREI
KONTRAHIERTEN
FIBROBLASTEN
INDUZIERTE
TRANSKRIPTE
.
59
4.2.4.1
ZELLZYKLUS-REGULATOREN,
TRANSKRIPTIONSASSOZIIERTE
GENE
UND
TRANSKRIPTIONS
FAKTOREN
.
59
4.2.4.2
INTRAZELLULAERE
SIGNALMODULATOREN
UND
DEREN
EFFEKTOREN,
LONENKANAELE
UND
LONENTRANSPORT
.
60
4.2.4.3
REZEPTOREN
UND
ZELLOBERFLAECHENANTIGENE
.
62
4.2.4.4
ZYTOKINE,
WACHSTUMSFAKTOREN,
CHEMOKINE
.
63
4.2.4.5
APOTOSE
UND
ZELLTOD/STRESSANTWORT
.
63
4.2.4.6
PROTEASEN
UND
KOMPONENTEN
DER
EXTRAZELLULAEREN
MATRIX
.
64
4.2.5
VERIFIZIERUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
GENEXPRESSION
.
65
4.2.5.1
UNTER
ISOMETRISCHEN
BEDINGUNGEN
STAERKER
INDUZIERTE
TRANSKRIPTE
.
65
4.2.5.2
UNTER
ISOTONISCHEN
BEDINGUNGEN
STAERKER
INDUZIERTE
TRANSKRIPTE
.
68
4.2.5.3
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
VON
CTGF
UND
TGF-SS1
.
70
4.2.5.4
AUSWIRKUNGEN
VON
MECHANISCHEN
KRAEFTEN
AUF
DIE
FOKALKONTAKTSTRUKTUR
UND
DIE
EXPRESSION
VON
A-SMA
.
71
4.2.5.5
EINFLUSS
DER
BESCHAFFENHEIT
DES
SUBSTRATES
UND
DER
ART
DER
MECHANISCHEN
STIMULATION
AUF
DIE
GENEXPRESSION
.
74
4.2.6
ZUSAMMENFASSUNG
UND
VERGLEICH
DER
BISHERIGEN
ERGEBNISSE
.
76
4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
EINES
MECHANISCH
REGULIERTEN
TRANSKRIPTES
UNBEKANNTER
FUNKTION
.
78
4.3.1
EXPRESSION
VON
B19-MRNA
IN
GEWEBEN
UND
KULTIVIERTEN
ZELLEN
.
78
4.3.2
SEQUENZANALYSE
.
80
4.4
EXPRESSION
VON
PLASMINOGEN-AKTIVATOR-LNHIBITOR-2
(PAI-2)
.
85
4.4.1
PAI-2-EXPRESSION
IN
MECHANISCH
GESTRESSTEN
FIBROBLASTEN
.
85
4.4.1.1
ZEITABHAENGIGKEIT
DER
MRNA-SYNTHESE
.
85
4.4.1.2
PAI-2-PROTEINEXPRESSION
.
86
4.4.1.2.1
EXPRESSION
IN
ZELLLYSATEN
KULTIVIERTER
FIBROBLASTEN
.
86
4.4.1.2.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PAI-2
LOKALISATION
.
87
4.4.2
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNG
DER
PAI-2-EXPRESSION
IN
PRIMAEREN
SKLERODERMIE
UND
KONTROLLFIBROBLASTEN
.
90
4.4.2.1
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
UND
-PROTEIN
IN
KULTIVIERTEN
FIBROBLASTEN
.
91
4.4.2.2
EINFLUSS
DER
KULTURBEDINGUNGEN
AUF
DIE
PAI-2
EXPRESSION
IN
SKLERODERMIE
UND
KONTROLLFIBROBLASTEN
.
93
4.4.2.2.1
ABHAENGIGKEIT
DER
PAI-2
EXPRESSION
VOM
SERUMGEHALT
DES
ZELLKULTURMEDIUMS
.
94
4.4.2.2.2
ABHAENGIGKEIT
DER
PAI-2
EXPRESSION
VON
DER
PASSAGENZAHL
UND
DER
ZELLDICHTE
.
96
4.4.2.2.3
ABHAENGIGKEIT
DER
PAI-2
EXPRESSION
VON
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSFAKTOREN
.
97
4.4.3
ZUSAMMENFASSUNG
DER
BISHERIGEN
ERGEBNISSE
.
98
5
DISKUSSION
.
100
5.1
TRANSKRIPTIONSPROFIL
MECHANISCH
GESTRESSTER
UND
FREI
KONTRAHIERTER
FIBROBLASTEN
.
102
5.1.1
IDENTIFIZIERUNG
DIFFERENTIELL
REGULIERTER TRANSKRIPTE
MITTELS
CDNA-MIKROCHIPANALYSE
.102
5.1.2
MECHANISCH
INDUZIERTE
GENPRODUKTE
.
103
5.1.3
IN
FREI
KONTRAHIERTEN
FIBROBLASTEN
INDUZIERTE
TRANSKRIPTE
.
107
5.1.4
DER
MECHANISCH
YYAKTIVIERTE
"
FIBROBLASTEN-PHAENOTYP
-
PARALLELEN
ZU
SITUATIONEN
IN
VIVO
.
109
5.2
CHARAKTERISIERUNG
MECHANISCH
INDUZIERTER
TRANSKRIPTE
.
112
5.2.1
KLON
B19
.
112
5.2.2
PAI-2
.
113
5.3
GENEXPRESSION
MECHANISCH
BELASTETER
FIBROBLASTEN
IM
KONTEXT
DES
YYTENSEGRITY
"
-
MODELLS
.
118
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
120
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
122
ABSTRACT
ERKLAERUNG
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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| author | Keßler, Daniela 1973- |
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