Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2002 |
| Beschreibung: | VII, 173 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
MELANOZYTAERE
LAESIONEN
.
1
1.2
GENETISCHE
VERAENDERUNGEN
WAEHREND
DER
TUMORIGENESE
.
3
1.3
VERAENDERTE
GENEXPRESSIONEN
WAEHREND
DER
METASTASIERUNG
.
8
1.3.1
ZELLADHAESIONSMOLEKUELE
IM
METASTASIENINGSPROZESS
.
8
1.3.2
AUFLOESUNG
DER
GEWEBEBARRIEREN
.
10
1.3.3
AUTOKRINES
WACHSTUM
DES
TUMORS
.
11
1.3.4
SUPPRIMIERUNG
DER
IMMUNANTWORT
.
12
1.3.5
APOPTOSERESISTENZ
.
12
1.3.6
VERAENDERUNG
DER
ZELLMOBILITAET
.
14
1.4
IDENTIFIZIERUNG
VON
METASTASIERUNGS-ASSOZIIERTEN
MOLEKUELEN
MIT
HILFE
DER
MRNA
DIFFERENTIAL
DISPLAY-METINODE
.
15
1.5
PHLDA1
.
17
1.6
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
20
2
ERGEBNISSE
.
22
2.1
PHLDAL-EXPRESSION
IN
ZELLLINIEN,
DIE
AUS
MELANOMPRIMAERTUMOREN
UND
MELANOMMETASTASEN
GENERIERT
WURDEN
.
22
2.2
GENERIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
MONOKLONALER
ANTI-PHLDAL-AK
.
23
2.2.1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
PHLDA1-PROTEIN
.
24
2.2.2
IMMUNISIERUNG,
FUSION
UND
TEST
DER
HYBRIDOMZELLEN
AUF
PHLDA1-REAKTIVE
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.
25
2.2.3
REAKTIVITAET
DER
MONOIDONALEN
ANTI-PHLDAL-AK
IM
WESTEMBLOT
.
26
2.2.4
REAKTIVITAET
DER
MONOKLONALEN
ANTI-PHLDA
1
-AK
AUF
INTAKTEN
ZELLEN
.
27
2.2.5
SPEZIFITAET
DER
MONOKLONALEN
ANTI-PHLDAL-AK
.
28
2.2.5.1
INHIBITION
DER
MONOKLONALEN
ANTI-PHLDAL-AK
.
28
2.2.5.2
MONOKLONALE
ANTI-PHLDAL-AK
AUF
INDUZIERBAREN
ZELLLINIEN
.
29
2.2.6
ZUSAMMENFASSUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTI-PHLDA
1
-ANTIKOERPER
.
31
2.3
PHLDAL-EXPRESSION
AUF
GEWEBESCHNITTEN
.
31
2.4
PHLDAL-EXPRESSION
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLLINIEN
.
38
2.4.1
INDUKTION
DER
PHLDAL-EXPRESSION
DURCH
PHORBOLESTER
.
41
2.5
LOKALISATION
VON
PHLDA1
IN
ZELLEN
.
43
2.6
BESTIMMUNG
DES
TRANSLATIONSSTARTPUNKTES
VON
PHLDA1
.
44
2.7
CHARAKTERISIERUNG
STABILER
PHLDAL-TRANSFEKTANTEN
.
47
2.7.1
PHLDAL-EXPRESSION
STABILER
TRANSFEKTANTEN
.
47
2.7.2
WACHSTUMSMORPHOLOGIE
DER
PHLDAL-TRANSFEKTANTEN
.
49
2.8
KLONIERUNGSEFFIZIENZ
.
52
INHALTSVERZEICHNIS
2.9
EINFLUSS
DER
KONSTITUTIVEN
PHLDAL-EXPRESSION
AUF
DAS
WACHSTUM
.
53
2.9.1
EINFUSS
VON
PHLDA1
AUF
DIE
FAEHIGKEIT
KOLONIEN
ZU
FORMEN
.
53
2.9.2
WACHSTUMSKURVEN
.
54
2.9.3
ZELLZYKLUS
.
55
2.10
APOPTOSE
.
57
2.10.1
ANNEXIN-V-BINDUNG
.
57
2.10.2
TDT-ABHAENGIGER
EINBAU
VON
FITC-DUTP
(TUNEL-ASSAY)
.
59
2.10.3
EINFLUSS
DER
PHLDAL-EXPRESSION
AUF
DEN
EFFEKT
VON
CHEMOTHERAPEUTIKA.
.60
2.11
SUCHE
NACH
INTERAKTIONSPARTNERN
VON
PHLDA1
.
61
2.11.1
GST-BINDEEXPERIMENTE
(GST
PULL
DOWN)
.
61
2.11.2
SUCHE
NACH
PHLDA
1
-BINDENDEN
PROTEINEN
MIT
HILFE
DES
YEAST
TWO
HYBRID
SCREEN
.
63
2.11.3
EXPRESSION
DER
PHLDAL-BATA
IN
S.
CEREVISIAE
.
63
2.11.3.1
TEST
AUF
AUTONOME
AKTIVIERUNG
DER
TRANSKRIPTION
DURCH
DIE
BAITS
.
64
2.11.3.2
YEAST
TWO
HYBRID
SCREEN
.
67
2.11.4
KOIMMUNPRAEZIPITATION
.
73
3
DISKUSSION
.
76
3.1
PHLDAL-EXPRESSION
IM
HUMANEN
MELANOM
.
76
3.2
STRUKTUR
UND
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
PHLDA1
.
77
3.3
FUNKTION
VON
PHLDA1
IM
HUMANEN
MELANOM
.
79
3.4
ZELLULAERE
INTERAKTIONSPARTNER
VON
PHLDA1
.
83
3.5
DIE
ROLLE
VON
PHLDA
1
WAEHREND
DER
TUMORIGENESE
DES
MELANOMS
.
87
3.6
AUSBLICK
.
88
4
MATERIAL
.
91
4.1
MATERIAL
UND
BEZUGSQUELLEN
.
91
4.1.1
GEWEBE
.
91
4.1.2
ZELLLINIEN
.
93
4.1.3
TRANSFEKTANTEN
.
94
4.1.4
S.
CEREVISIAE-STAEMME
.
95
4.1.5
E.
CO/I-STAEMME
.
95
4.1.6
POLYKLONALE
SEREN
UND
ANTIKOERPERKONJUGATE
.
96
4.1.7
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.
97
4.1.8
ENZYME
.
98
4.1.9
NUKLEINSAEUREN
.
99
4.1.9.1
PLASMIDE
.
99
4.1.9.2
PRIMER
.
99
4.1.10
SONSTIGE
NUKLEINSAEUREN
UND
OLIGONUKLEOTIDE
.
101
4.1.11
GROESSENSTANDARDS
.
101
4.1.12
CHEMIKALIEN
.
101
4.1.13
KOMMERZIELLE
ANALYSESYSTEME
UND
VORGEFERTIGTE
LOESUNGEN
.
103
4.1.14
VERBRAUCHSMATERIAL
.
104
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.15
GERAETE
.
105
4.2
MEDIEN
.
106
4.2.1
ZELLKULTURMEDIEN
FUER
MAMMALIA-ZELLLINIEN
.
106
4.2.2
S.
CEREVISIAE-MEDIEN
.
106
4.2.3
E.
CO/I-MEDIEN
.
107
43
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
108
5
METHODEN
.
112
5.1
ARBEITEN
MIT
MENSCHLICHEM
GEWEBE
.
112
5.1.1
HERSTELLUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
.
112
5.2
ARBEITEN
MIT
ZELLLINIEN
.
112
5.2.1
ZELLKULTUR
.
112
5.2.2
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
SAEUGERZELLEN
.
112
5.2.3
STIMULATION
DER
ZELLEN
MIT
PHORBOLESTER
.
113
5.2.4
TRANSFEKTION
VON
SAEUGERZELLEN
IN
DER
ZELLKULTUR
.
113
5.2.4.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
.
113
5.2.4.2
STABILE
PHLDAL-TRANSFEKTANTEN
.
114
5.2.5
WACHSTUMSKURVEN
UND
MTT-ELISA
.
114
5.2.6
KOLONIE-FORMATIONS-ASSAY
.
115
5.2.7
KLONIERUNGSEFFIZIENZ
.
115
5.2.8
HERSTELLUNG
VON
ZYTOSPINPRAEPARATEN
.
115
53
ARBEITEN
MIT
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
116
5.3.1
KULTIVIERUNG
VON
S.
CEREVISIAE
.
116
5.3.2
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
S.
CEREVISIAE
.
116
5.3.3
YEAST
TWO
HYBRID
SCREEN
.
117
5.3.3.1
VORARBEITEN
FUERDENJ'EAS?
TWO
HYBRID
SCREEN
.
117
53.3.2
UEBERPRUEFUNG
AUF
AUTONOME
AKTIVIERUNG
DER
TRANSKRIPTION
.
118
5.33.3
ABLAUF
DES
YEAST
TWO
HYBRID
SCREENS
.
119
5.33.4
KREUZUNG
VON
S.
CEREVISIAE
IMYEAST
TWO
HYBRIDSCREEN
.
121
5.33.5
BESTIMMUNG
DER
KREUZUNGSEFFIZIENZ
UND
DER
ANZAHL
DER
GESCREENTEN
KLONE
.
123
5.33.6
BESTIMMUNG
DER
TRANSFORMATIONSEFFIZIENZ
UND
ANZAHL
DER
GESCREENTEN
KLONE
.
123
53.3.7
LACZ-FILTERASSAY
FUER
DEN
YEAST
TWO
HYBRIDSCREEN
.
124
5,4
ARBEITEN
MIT
ESCHERICHIA
COLI
.
124
5.4.1
KULTIVIERUNG
VON
E.
COLI
.
124
5.4.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
125
5.4.2.1
TRANSFORMATION
VON
CACH
BEHANDELTEN
E.
COLI
.
125
5.4.2.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
125
5.4.3
AMPLIFIKATION
EINER
CDNA
GENBANK
IN
E.
COLI
.
126
5.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
127
5.5.1
HANDHABUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
NACH
SAMBROOK
ET
AL.,
1989
.
127
5.5.1.1
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
VON
DNA
.
127
5.5.1.2
FAELLUNG
VON
DNA/RNA
.
127
INHALTSVERZEICHNIS
5.5.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA/RNA
.
127
5.5.2
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
128
5.5.2.1
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
128
5.5.2.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID
DNA
AUS
E.
COLI
MIT
SPIN
CO/UMN-SAEULEN
.
128
5.5.2.3
MAXIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
129
5.5.2.4
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
S.
CEREVISIAE
.
129
5.5.2.5
ISOLATION
VON
MRNA
AUS
SAEUGERZELLLINIEN
.
130
5.5.3
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MIT
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
130
5.5.4
REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
PCR
(RT-PCR)
.
131
5.5.5
IN
VITRO-MODIFIKATION
VON
DNA
NACH
SAMBROOK
ET
AL.,
1989
.
132
5.5.5.1
RESTRIKTION
VON
DNA
.
132
5.5.5.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARER
DNA-FRAGMENTE
.
132
5.5.5.3
PHOSPHORYLIERUNG
LINEARER
DNA-FRAGMENTE
.
132
5.5.5.4
ENTFERNUNG
VON
3
'-UEBERHAENGENDEN
DNA-FRAGMENT-ENDEN
.
132
5.5.5.5
AUFFIULEN
VON
5
'-UEBERHAENGENDEN
DNA-FRAGMENT-ENDEN
.
133
5.5.5.6
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
133
5.5.6
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
133
5.5.6.1
ISOLATION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
134
5.5.7
KLONIERUNGEN
.
134
5.5.7.1
PHLDA1
IN
PAS2-L
.
135
5.5.7.2
PHLDA1
IN
PCDNA3
.
136
S.5.7.3
PHLDA1
INPCDNA3.1
.
136
5.5.7.4
PHLDA1
IN
PGEX4T
.
137
5.5.7.5
GST-FUSIONSKONSTRUKTE
ZUR
EXPRESSION
IN
MAMMALIA-ZELLEN
.
138
5.6
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
138
5.6.1
ZELLAUFSCHLUSS
VON
MAMMALIA-ZELLLINIEN
.
138
5.6.2
ZELLAUFSCHLUSS
VON
S.
CEREVISAE
.
139
5.6.3
ZELLAUFSCHLUSS
VON
E.
COLI
.
139
5.6.3.1
DIREKTE
LYSE
VON
E.
COLI
FUER
DIE
SDS-PAGE
.
139
5.6.4
MESSUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
140
5.6.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
(SDS-PAGE)
.
140
5.6.6
COOMASSIE-FAERBUNG
.
141
5.6.7
WESTERN
BLOT
.
141
5.6.8
IMMUNDETEKTION
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
.
142
5.6.8.1
ENTFERNUNG
VON
IMMUNKOMPLEXEN
VON
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
.
142
5.6.9
ETABLIERUNG
DER
EXPRESSION
VON
GST-PHLDAL
IN
E.
COLI
.
143
5.6.10
REINIGUNG
VON
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
GST-FUSIONSPROTEINEN
.
145
5.6.11
GST-BINDE-EXPERIMENTE
(GST
PULL
DOWN)
.
145
5.6.12
KOIMMUNPRAEZIPITATION
.
146
5.7
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
147
5.7.1
GENERIERUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
PHLDA1
.
147
5.7.1.1
IMMUNISIERUNG
.
147
5.7.1.2
FUSION
VON
MILZ
UND
MAUS-MYELOMZELLEN
.
147
5.7.1.3
TEST
DER
HYBRIDOMUEBERSTAENDE
IM
ELISA
.
148
5.7.1.4
ISOTYPBESTIMMUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
148
5.7.2
IMMUNHISTOCHEMIE
.
148
5.7.3
IMMUNFLUORESZENZ
.
149
5.7.3.1
IMMUNFLUORESZENZ
VON
OBERFLAECHENANTIGENEN
.
150
5.7.3.2
ZYTOPLASMATISCHE
IMMUNFLUORESZENZ
.
150
INHALTSVERZEICHNIS
S.7.3.3
AUSWERTUNG
IM
FLUORESZENZMIKROSKOP
.
150
5.7.3.4
AUSWERTUNG
IM
FACSCAN
.
151
5.7.4
ANNEXIN-V-BINDUNG
.
151
5.7.5
APOPTOSEINDUKTION
MIT
DOXORUBICIN
.
152
5.7.6
TCWEZ-ASSAY
.
152
5.7.7
ZELLZYKLUSANALYSEN
.
153
5.8
COMPUTERANALYSEN
.
154
5.8.1
SEQUENZALIGNEMENT
MIT
GENBANK
DNA-SEQUENZEN
.
154
5.8.2
SEQUENZALIGNEMENT
VON
PROTEINEN
.
154
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
155
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
157 |
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