Untersuchungen zum Einfluß von Oligonukleotid-Facilitators auf die Aktivität von RNA-spaltenden DNA-Enzymen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Dresden, Techn. Univ., Diss., 2000 |
| Beschreibung: | 172 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
1
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
.
8
A.
EINFUEHRUNG
UND
PROBIEMSTEUUNG
.
10
B.
ALLGEMEINER
TEIL
.
13
1.
KATALYTISCHE
NUKLEINSAEUREN.
.
13
2.
DAS
10-23
DNA-ENZYM
.
16
2.1.
DIE
10-23
DNA-ENZYM-KONSENSUS-STRUKTUR
.
16
2.2.
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DES
10-23
DNA-ENZYMS
.
17
2.3.
DER
MECHANISMUS
DER
10-23
DNA-ENZYM-REAKTION
.
19
2.4.
DIE
KINETIK
DER
10-23
DNA-ENZYM-REAKTION
.
20
2.5.
GENINAKTIVIERUNG
MIT
DEM
10-23
DNA-ENZYM
.
22
2.6.
VERGLEICH
10-23
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-KBOZYM
.
23
3.
OLIGONUKLEOTID-FACRZR/ATORS
.
25
4.
FLUORESZENZ-RESONANZ-ENERGIE-TRANSFER
.
28
C. ERGEBNISSE
.
30
1.
AUSWAHL
DES
MODELLSYSTEMS
.
31
2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
AKTIVITAET
DES
DNA-ENZYMS
.
34
2.1.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
DNA-ENZYM-SUBSTRAT-ASSOZIATION
.
34
2.1.1.
BESTIMMUNG
DER
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTE
DER
DNA-ENZYM-SUBSTRAT
ASSOZIATION.
.
35
1
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
GESCHWINDIGKEIT
DER
ASSOZIATION
VON
DNA-ENZYM
UND
SUBSTRAT
.
39
2.1.3.
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTE
DES
DNA-ENZYM-SUBSTRAT
KOMPLEXES
.
41
2.1.4.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
STABILITAET
DES
DNA-ENZYM-SUBSTRAT
KOMPLEXES
.
46
2.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DEN
SPALTSCHRITT
DER
DNA
ENZYM
REAKTION
.
47
2.2.1.
BESTIMMUNG
DER
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTE
DES
SPALTSCHRITTES.
.
47
2.2.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
GESCHWINDIGKEIT
DES
SPALTSCHRITTES
.
48
2.3.
EINFLUSS
DA
FACILITATORS
AUF
DEN
MULTIPLE-TURNOVER
VERLAUF
DER
DNA-ENZYM
REAKTION
.
50
2.3.1.
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-MENTEN-PARAMETER
.
50
2.3.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
MULTIPLE-TURNOVER-AKDVITLIT
DES
DNA
ENZYMS
.
52
2.4.
ABHAENGIGKEIT
DES
FACILITATOR-EFFEKTES
VON
DER
SUBSTRATSEQUENZ
.
54
2.4.1.
BESTIMMUNG
DES
FACI/ITAROR-EINFLUSSES
AUF
DIE
DNA-ENZYM
B
AKDVITAET
.
55
2.4.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
DNA-ENZYM
B-AKTIVITAET
.
55
3.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
DNA-ENZYM-AKTIVITAET
.
56
3.1.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
ASSOZIATION
.
57
3.1.1.
BESTIMMUNG
DER
ASSOZIATIONSGESCHWINDIGKEITSKONSTANTE
.
57
3.1.2.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
ASSOZIATION
.
57
3.1.3.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
ASSOZIATION
VON
VERLAENGERTEN
DNA
ENZYMEN
.
59
3.1.4.
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
DER
DNA-ENZYM-SUBSTRAT
KOMPLEXE
.
60
3.1.5.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
DISSOZIATIONSKONSTARTE
INHALTSVERZEICHNIS
1
DES
DNA-ENZYM-SUBSTRAT-KOMPLEXES
.
61
3.2.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERIAENGERUNG
AUF
DEN
SPALTSCHRITT
DER
DNA-ENZYM
REAKTION
.
62
3.2.1.
BESTIMMUNG
DER
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTE
DES
SPALTSCHRITTES.
.
62
3.2.2.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERIAENGERUNG
AUF
DEN
SPALTSCHRITT
.
62
3.3.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERIAENGERUNG
AUF
DEN
MULTIPLE-TURNOVER
VERLAUF
DER
DNA-ENZYM-REAKTION.
.
63
3.3.1.
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-MENTEN-PARAMETER
.
63
3.3.2.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERIAENGERUNG
AUF
DIE
MULTIPLE
TURNOVER
AKTIVITAET64
3.3.3.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
MULTIPLE-TURNOVER-NDSV'ITSK
DA
VERLAENGERTEN
DNA-ENZYME
.
65
4.
EINFLUSS
DES
FACILITATORS
AUF
DIE
HYBRIDISIERUNGSREAKTION
VON
KOMPLEMENTAEREN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
67
4.1.
BESTIMMUNG
DER
HYBRIDISIENMGSGESCHWINDIGKEIT
.
68
4.2.
EINFLUSS
DES
FACILITATORS
AUF
DIE
HYBRIDISIERUNGSGESCHWINDIGKEIT
.
71
5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
VON
ZELLULAEREN
KOMPONENTEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEA
J-RIBOZYM
.
75
5.1.
CELL-UPTAKE
UND
STABILITAET
VON
DNA-ENZYMEN
UND
HAMMERHEAD-WOCAYM
.
76
5.1.1.
UNTERSUCHUNG
DES
CELL-UPTAKES
.
76
5.1.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STABILITAET
VON
DNA-ENZYMEN
UND
HAMMERHEAD
RIBOZYM
.
77
5.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
ZELLULAERER
KOMPONENTEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA
ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
.
80
5.2.1.
EINFLUSS
VON
CYTOSOL
UND
KEMEXTRAKTEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RBXAYM
.
80
5.2.2.
EINFLUSS
DA
FACILITATORS
AUF
DIE
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBAZYM
REAKTION
IN
ZELLEXTRAKTEN
.
83
I
_
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.3.
EINFLUSS
VON
GESAMT-RNA
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
.
85
5.2.4.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
DNA
ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
REAKTION
MIT
GESAMT-RNA
.
88
D.
DISKUSSION
.
91
1.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
AKTIVITAET
DES
DNA
ENZYMS
.
91
1.1.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
DNA-ENZYM-SUBSTRAT-ASSOZIATION.
.
91
1.1.1.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
GESCHWINDIGKEIT
DER
DNA-ENZYM-SUBSTRAT
ASSOZIATION
.
91
1.1.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
STABILITAET
DES
DNA-ENZYM-SUBSTRAT
KOMPLEXES
.
94
1.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DEN
SPALTSCHRITT
DER
DNA
ENZYM-REAKTION
.
97
1.3.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
DIE
MULTIPLE-TURNOVER
AKTIVITAET
DES
DNA
ENZYMS
KM
1.4.
ABHAENGIGKEIT
DER
FACILITATOR
WIRKUNG
VON
DER
SUBSTRATSEQUENZ
.
104
2.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
DNA-ENZYM-AKTIVITAET
.
106
2.1.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
ASSOZIATION
.
106
2.1.1.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
GESCHWINDIGKEIT
DER
DNA
ENZYM
SUBSTRAT-ASSOZIATION
.
106
2.1.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
GESCHWINDIGKEIT
DER
ASSOZIATION
DER
VERLAENGERTEN
DNA-ENZYME
.108
2.1.3.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
STABILITAET
DES
DNA-ENZYM
SUBSTRAT-KOMPLEXES
.
109
2.2.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DEN
SPALTSCHRITT
DER
DNA-ENZYM
REAKTION
.
HO
2.3.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DEN
MULTIPLE
TURNOVER
VERLAUF
DER
DNA-ENZYM-REAKTION
.
111
2.3.1.
EINFLUSS
DER
STAMMSEQUENZVERLAENGERUNG
AUF
DIE
MULTIPLE
TUMOVER
AKTIVITAET
111
INHALTSVERZEICHNIS
_
I
2.3.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
MULTIPLE-TURNOVER
AKTIVITAET
DER
VERLAENGERTEN
DNA-ENZYME
.
113
3.
EINFLUSS
DES
FACILITATORS
AUF
DIE
HYBRIDISIERUNGSREAKTION
VON
KOMPLEMENTAEREN
OLIGONUKLEOTIDEN
.114
4.
EINFLUSS
VON
ZELLULAEREN
KOMPONENTEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD
RIBOZYM
.
116
4.1.
CELL
UPTAKE
UND
STABILITAET
VON
DNA-ENZYMEN
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
.116
4.2.
EINFLUSS
ZELLULAERER
KOMPONENTEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD
RIBOZYM
.118
4.2.1.
EINFLUSS
VON
CYTOSOL
UND
KEMEXTRAKTEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
.118
4.2.2.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
REAKTION
IN
ZELLEXTRAKTEN
.
119
4.2.3.
EINFLUSS
VON
GESAMT-RNA
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-RIBOZYM
.119
4.2.4.
EINFLUSS
DER
FACILITATORS
AUF
DIE
REAKTION
VON
DNA-ENZYM
UND
HAMMERHEAD-KBOZYM
IN
GEGENWART
VON
GESAMT-RNA
.
120
5.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
123
E.
EXPERIMENTELLER
TEIL
.
125
1.
GERAETE
UND
MATERIALIEN
.
125
1.1.
GERAETE
.
125
1.2.
MATERIALIEN.
.
126
2.
LOESUNGEN
UND
PUFIER
.
127
3.
GELELEKTROPHORESE
.
130
3.1.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.
.
130
3.1.1.
VORBEREITUNG
DER
GELKAMMEM.
.
130
INHALTSVERZEICHNIS
6
_
3.1.2.
20%IGE
DENATURIERENDE
POLYACTYLAMIDGELE
.130
3.1.3.
4%IGE
DENATURIERENDE
POLYACTYLAMIDGELE
.
131
3.2.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
131
3.2.1.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
DER
DNA
.
131
3.2.2.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
DER
RNA
.
131
4.
ABSORPTIONS
UND
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
.
131
5.
SYNTHESE,
REINIGUNG
UND
MARKIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.132
5.1.
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
DER
OLIGORIBONUKLEOTIDE
.
132
5.2.
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
DER
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
.
133
5.3.
MARKIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.
134
5.3.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MIT
32
P
.
134
5.3.2.
MARKIERUNG
MIT
FLUORESCEIN.
.135
6.
KULTIVIERUNG
VON
MCF
7
ZELLEN
.
136
6.1.
UMSETZUNG
VON
MCF-7
ZELLEN
.
136
6.2.
EINFRIEREN
UND
LAGERUNG
VON
MCF
7
ZELLEN
.
137
7.
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
MCF-7
.
137
7.1.
AUFARBEITUNG
DER
MCF-7
ZELLEN
.
137
7.2.
PRAEPARATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
GESAMT-RNA
.
137
8.
PRAEPARATION
VON
KEMEXTRAKTEN
AUS
MCF-7
ZELLEN
.
139
8.1.
PRAEPARATION
DER
KEMEXTRAKTE
.
139
8.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
KEMEXTRAKTE
.
139
9.
PRAEPARATION
VON
CYTOSOL
AUS
MCF-7
ZELLEN
.
140
9.1.
PRAEPARATION
DES
CYTOSOLS
.
140
9.2.
CHARAKTERISIERUNG
DES
CYTOSOLS
.
140
10.
PCR.
.
140
INHALTSVERZEICHNIS
_
1
10.1.
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
DER
PCR-PRIMER
.
141
10.2.
AMPLIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
.
141
11.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
142
11.1.
AUFARBEITUNG
DES
IN
VITRO
TRANSKRIPTIONS
TEMPLATES
.
142
11.2.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION,
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
TRANSKRIPTES
.142
12.
RNASE
PROTECTION
ASSAY.
.144
13.
CE/Z-I7PRAKE-UNTERSUCHUNGEN
IN
MCF-7
ZELLEN
.
145
13.1.
TRANSFEKTION
VON
MCF-7
ZELLEN
.
145
13.2.
AUSWERTUNG
DES
CELL-VPTAKES
.
145
14.
ENZYMREAKTIONEN
.
146
14.1.
REAKTIONSFILHRUNG.
.
146
14.1.1.
DNA-ENZYM-REAKTIONEN
.
146
14.1.2.
DNA-ENZYM-UND
RIBOZYMREAKTIONEN
IN
GEGENWART
VON
GESAMT
RNA146
14.1.3.
DNA-ENZYM-UND
RIBOZYMREAKTIONEN
IN
KEM-UND
CYTOSOLEXTRAKTEN.
.
147
14.2.
AUSWERTUNG
DER
ENZYMREAKTIONEN
.
147
15.
HYBRIDISIERUNGSKINETIK
MITTELS
UNSPEZIFISCHEN
FLUORESZENZ-RESONANZ-ENERGIE-TRANSFERS.
148
15.1.
ASSOZIATIONSREAKTIONEN
.
148
15.2.
DISSOZIATIONSREAKTIONEN
.
148
F.
ZUSAMMENFASSUNG
.
.150
G.
LITERATURVERZEICHNIS
.
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