Simultane Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten gerichtet gegen Adeno- und Epstein-Barr-Virus-Epitope, zur Therapie von opportunistischen Infektionen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSCT):
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN_10
EINLEITUNG_12
HAEMATOPOETISCHE STAMMZELLDIFFERENZIERUNG.13
DENDRITISCHE ZELLEN.14
AKTIVIERUNG VON T-LYMPHOZYTEN.22
MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER T-ZELLVERMITTELNDEN ZYTOTOXIZITAET.23
DAS HLA-SYSTEM.24
ANTIGENPRAESENTATION UEBER MHC-I/ MHC-UE-TRANSPORTROUTE.26
HISTORISCHE ENTWICKLUNG DER KNOCHEN-
UND STAMMZELLTRANSPLANTATION.28
ERSTE KLINISCHE VERSUCHE.30
INDIKATION FUER EINE YYHAEMATOPOETISCHE STAMMZELLTRANSPLANTATION (HSCT).32
VORBEREITUNGSMASSNAHMEN BEI EINER ALLOGENEN HSCT.33
DIE REKONSTITUTION DES IMMUNSYSTEMS POST HSCT.34
WIEDERAUFBAU DER T- ZELL IMMUNITAET.34
WIEDERAUFBAU DER B- ZELL IMMUNITAET.36
FAKTOREN, DIE EINE RESTAURATION DES IMMUNSYSTEM BEEINTRAECHTIGEN.38
OPPORTUNISTISCHE INFEKTIONEN.40
ADOPTIVE IMMUNTHERAPIE FUER VIRUSASSOZIIERTE ERKRANKUNGEN.41
EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV).45
LATENTE INFEKTION.46
IMMUNREAKTIONEN GEGEN EBV UND FLUCHTMECHANISMEN DES VIRUS.47
ADENOVIREN (ADV).50
BINDUNG UND INTEMALISATION DES ADV.51
ADENO VIRALE IMMUNEVASIONS- MECHANISMEN.52
IMMUNREAKTIONEN GEGEN ADENOVIRUS.53
ZIELE DER ARBEIT.54
5
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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MATERIAL UND METHODEN
_55
GERAETE.55
VERBRAUCHSMATERIALIEN.56
ZELLKULTURMEDIEN UND REAGENZIEN.56
ZUSAETZE VON ZELLKULTURMEDIEN.57
ZYTOKINE.57
CHEMIKALIEN. 57
ANTIKOERPER (MAUS ANTI HUMAN).58
ZELLINIEN.60
VIREN.60
EXTRAKTION VON MONONUKLEAEREN ZELLEN
DES PERIPHEREN BLUTES (PBL).61
ZAEHLEN VON ZELLEN.62
KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN.62
AUFTAUEN VON ZELLEN.63
KULTUR VON ADHAERENTEN ZELLINIEN.63
KULTUR VON DENDRITISCHEN ZELLEN (DCS).64
PHAENOTYPISCHE ANALYSE VON DCS.64
FAERBUNG MIT FLUORESZENZMARKIERTEN MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.65
DURCHFUSSZYTOMETRISCHE-ANALYSE.66
ZYTOSPIN.66
BESTIMMUNG DER ENDOCYTOTISCHEN KAPAZITAET VON DCS (FITC-DEXTRAN).66
GEWINNUNG VON B95-8 - KULTURUEBERSTAENDEN.67
EBV-TRANSFORMIERTE B-ZELL LINIEN (LCL).68
INFEKTION VON DCS MIT DEM ADENOVIRUS TYP 5. 69
ADENOVIRALE INFEKTION VON DCS MIT LIPOFECTAMIN.69
WILDTYP VIREN.70
BESTIMMUNG UND BLOCKIEREN DER CD51-EXPRESSION AUF DENDRITISCHEN
ZELLEN.71
DETEKTION DER EXPRESSION DES COXSACKIE-
UND ADENOVIRUSREZEPTORS YYCAR" AUF DCS UND LCLS.72
KOKULTUR VON LCLS AUF HUCD40L-EXPRIMIERENDEN
MAUSFIBROBLASTEN (L-CD40L).72
ADENOVIRALE INFEKTION VON LCL.73
GEMISCHTE LYMPHOCYTEN REAKTION (MLR = MIXED LYMPHOCYTE REACTION).73
AUTOLOGE MLR.75
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG PROLIFERIERENDER T-ZELLEN.75
GENERIERUNG UND EXPANSION ADV-SPEZIFISCHER ZTL.75
GENERIERUNG UND EXPANSION ADV/EBV -SPEZIFISCHER ZTL.76
VORBEREITUNG DER ZIELZELLEN FUER DEN ZYTOTOXIZITAETS-ASSAY.77
STANDARD CHROMFFEISETZUNGS TEST (CHROMIUM-51 RELEASE ASSAYS).78
MESSUNG DER SPEZIFISCHEN ZYTOTOXIZITAET.79
MHC-INHIBITIONS ASSAY.80
IMMUNOPHAENOTYPISIERUNG VON ZTL.80
STATISTISCHE AUSWERTUNG DER BEOBACHTETEN ERGEBNISSE.81
BERECHNUNG DER MULTIPLICITY OF INFECTION (MOI).- .82
ERGEBNISSE
_83
TEIL I: DIE
IN VITRO GENERIERUNG ADV-SPEZIFISCHER CTL.83
GENERIERUNG VON DENDRITISCHEN ZELLEN
UNTER VERSCHIEDENEN KULTURBEDINGUNGEN.85
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG UNREIFER UND REIFER DCS.88
PROZENTUALE VERTEILUNG DER DC-OBERFLAECHENMARKER.89
DOTPLOT-ANALYSEN VON DC-KULTUREN UNTERSCHIEDLICHER KULTURBEDINGUNGEN.90
TESTSYSTEME ZUR UEBERPRUEFUNG DER FUNKTIONALITAET VON DCS.91
UNTERSUCHUNG DER AUFNAHMEKAPAZITAET VON FITC-DEXTRAN
UEBER DEN MANNOSEREZEPTOR. .92
AUFNAHMEKAPIZITAET DES ADENOVIRUS.93
IMMUNHISTOLOGISCHE DARSTELLUNG ADV-GFP
+-DCS.94
VERGLEICH DER IMMUNSTIMULATORISCHEN KAPAZITAET VON DCS.96
VERGLEICH DES EINFLUSSES DER KULTURBEDINGUNGEN AUF DIE DCS.97
INFEKTION VON DCS MIT REKOMBINANTEM ADENOVIRUS TYP 5.98
VERGLEICH DER INFEKTIONSKAPAZITAET UNREIFER DCS + LIPOFECTAMIN.99
VERGLEICH DER INFEKTIONSKAPAZITAET UNREIFER UND REIFER DCS.100
OBERFLAECHENPROFIL ADV-GFP-TRANSFIZIERTER DCS.101
FLUORESZENZANALYSE ADV-GFP-TRANSFIZIERTER DCS.102
DER EFFEKT VON TNF-A AUF DIE EXPRESSION VON CD51 AUF DCS.104
DOSISABHAENGIGE INHIBIERUNG DER CD51-EXPRESSION DURCH TNF-A.105
EINFLUSS DER CD51-EXPRESSION AUF DIE ADENOVIRALE INFEKTION VON DCS.106
DER EFFEKT VON TNF-A AUF DIE EXPRESSION
VON AVSSL-INTEGRINREZEPTOREN UND YYCAR" AUF DCS.107
UEBERPRUEFUNG DER IMMUNSTIMULATORISCHEN KAPAZITAET
VON ADENOVIRUS INFIZIERTE UND REIFE DC IN MLR-ASSAYS.110
ALLOGENE MLR.111
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG DER ALLOGENEN T-ZELLEN.112
AUTOLOGE MLR.113
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG DER PROLIFERIERENDEN AUTOLOGEN T-ZELLEN.114
IN VITRO
EXPANSION ADV-SPEZIFISCHER ZTL.115
BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN ZYTOTOXIZITAET VON ADV-ZTL-LINIEN.117
MHC-ABHAENGIGKEIT DER ADV-SPEZIFISCHEN ZYTOTOXIZITAET.118
OBERFLAECHENPROFIL ADV-SPEZIFISCHER ZTL-LINIEN.7.119
KREUZREAKTIVITAET ADV-SPEZIFISCHER ZTL.121
MHC-INHIBIERUNG KREUZREAKTIVER ADV
+ZTL.122
TEIL II: DIE
IN VITRO GENERIERUNG ADV- UND EBV SPEZIFISCHER ZTL.123
ADV-INFEKTION VON B-LCLS.124
DURCHFLUZSSZYTOMETRISCHE ANALYSE ADV-INFIZIERTER B-LCLS.124
VIABILITAET ADV-INFIZIERTER B-LCLS.125
KOKULTIVIERUNG VON LCLS AUF CD40 LIGAND-EXPRIMIERENDEN MONOLAYEM.128
ANALYSE DER CD51-EXPRESSION UND DER INFEKTIONSKAPAZITAET
DURCH ADV NACH KOKULTIVIERUNG DER
B-LCLS AUF CD40L-EXPRIMIERENDEN MONOLAYEM.130
EXPRESSION VON CD49F VOR UND NACH COKULTIVIERUNG.132
IMMUNSTIMULATORISCHE KAPAZITAET ADV- INFIZIERTER LCLS.133
ALLOGENE MLR. 133
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG DER ALLOGENEN T-ZELLEN.134
AUTOLOGE MLR.135
PHAENOTYPISIERUNG DER AUTOLOGEN T-ZELLEN.136
SIMULTANE
IN VITRO EXPANSION ADV- UND EBV-SPEZIFISCHER ZTL.136
BESTIMMUNG DER ZYTOTOXISCHEN AKTIVITAET ADV/EBV-SPEZIFISCHER ZTL.137
MHC-ABHAENGIGKEIT DER ADV-UND EBV-SPEZIFISCHEN CYTOTOXIZITAET.138
8
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG YYBISPEZIFISCHER" ZTL-LINIEN.139
BESTIMMUNG DER ZYTOTOXISCHEN AKTIVITAET YYMONOSPEZIFISCHER"
EBV-SPEZIFISCHER ZTL.140
IMMUNPHAENOTYPISIERUNG YYMONOSPEZIFISCHER" LCL-ZTL-LINIEN.141
ANALYSE DER KREUZREAKTIVITAET YYBISPEZIFISCHER ZTL.142
DISKUSSION.144
ZUSAMMENFASSUNG
.160
LITERATURVERZEICHNIS
.162
ANHANG
PUBLIKATIONSLISTE.181
CURRICULUM VITAE.182
9 |
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