Porcine endogene Retroviren als Risiko bei der Xenotransplantation?: Infektionsstudien in vitro und Inokulation von Kleintieren und nicht-humanen Primaten in vivo
Gespeichert in:
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| Veröffentlicht: |
Berlin
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2002
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INHALT
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 Xenotransplantation 1
1.1.1 Mögliche Spendertiere 3
1.1.2 Immunologie der Xenotransplantation 4
1.2 Mikrobiologische Risiken bei der Xenotransplantation 7
1.2.1 Infektionsgefahren 8
1.2.2 Retroviren 9
1.2.2.1 Das pathogene Potential von Retroviren 10
1.2.2.2 Einteilung der Retroviren 11
1.2.2.3 Morphologie der Gammaretroviren 13
1.2.2.4 Replikation der Gammaretroviren 15
1.2.3 Porcine endogene Retroviren (PERVs) 20
1.3 Zielsetzung 25
2. MATERIAL UND METHODEN 27
2.1 Zellbiologische Methoden 27
2.1.1 Verwendete Zellen 27
2.1.2 Isolation primärer Zellen 29
2.1.2.1 Isolation von Blutleukozyten 29
2.1.2.2 Isolation von Milzzellen 29
2.1.2.3 Isolation von Nierenzellen und Embryo Zellen 29
2.1.2.4 Isolation von Tumorzellen 30
2.1.3 Kultivierung von Zellen 30
INHALT .
2.1.3.1 Suspensionskulturen 30
2.1.3.2 Adhärente Zellen 30
2.1.3.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 31
2.2 Molekularbiologische Methoden .31
2.2.1 Isolation von Nukleinsäuren 31
2.2.1.1 Isolation von genomischer DNA aus kultivierten Zellen 31
2.2.1.2 Isolation von genomischer DNA aus kultivierten Zellen
im 96 well Maßstab 31
2.2.1.3 Isolation von genomischer DNA aus Gewebe 32
2.2.1.4 Isolation von Plasmid DNA aus Bakterien 32
2.2.1.5 Isolation von viraler RNA aus Zellkulturüberstand 32
2.2.1.6 Isolation von viraler RNA aus Plasma 33
2.2.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 33
2.2.2.1 Nachweis der Sensitivität der PCR 34
2.2.2.2 Nested PCR 35
2.2.2.3 Reverse Transkription PCR (RT PCR) 35
2.2.2.4 Lyse PCR aus kultivierten Zellen im 96 well Maßstab 35
2.2.2.5 Kolonie PCR aus Bakterien 35
2.2.3 Klonierung 35
2.2.3.1 Restriktion von DNA 36
2.2.3.2 Ligation von DNA 36
2.2.3.3 Transformation von Bakterien 37
2.2.3.4 Sequenzierung 37
2.2.4 Expressionsstudien 37
2.2.4.1 Transfektion eukaryotischer Zellen 38
INHALT
2.3. Immunologische Methoden .38
2.3.1 Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) 38
2.3.2 Immunoperoxidase Assay (IPA) 39
2.3.3 Western Blot Assay (WB) 40
2.3.4 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Analyse 40
2.3.5 Histochemie (HC) 41
2.3.6 Immun Histochemie (IHC) 41
2.4 Mikroskopie 42
2.4.1 Irnmun Fluoreszenzmikroskopie(IFM) 42
2.4.2 Transmissions Elektronenmikroskopie(TEM) 43
2.4.3 Raster Elektronenmikroskopie (REM) 43
2.5 Virologische Methoden 43
2.5.1 Isolation von Viren aus Zellkulturüberstand 43
2.5.2 Nachweis von Reverser Transkriptase (RT) Aktivität (RT Test) 44
2.5.3 Virustitration 44
2.5.4 In vitro Infektion kultivierter Zellen 45
2.5.5 In vivo Infektionsversuche 45
2.5.5.1 Verwendete Immunsuppressiva 46
2.5.5.2 In vivo Infektion von Kleintieren 51
2.5.5.3 In vivo Infektion von nicht humanen Primaten 53
3. ERGEBNISSE 57
3.1 Das Wirtsspektrum von PERV in vitro 57
3.1.1 Die Infektion von Zellen verschiedener Kleintiere 57
3.1.1.1 Die Infektion der Nerzzell LinieMvlLu 59
3.1.2 Die Infektion von Zellen nicht humaner Primaten 64
in
INHALT 3.1.3 Die Infektion von humanen Zellen 68
3.1.4 Die Adaptation von PERV an humane Zellen 70
3.2 Das Wirtsspektrum von PERV in vivo 81
3.2.1 Die Inokulation von Kleintieren 81
3.2.2 Die Inokulation von nicht humanen Primaten 86
4. DISKUSSION 97
4.1 Die Infektion von Zellen mit PERV in vitro 97
4.1.1 Die Infektion von Zellen verschiedener Kleintiere 97
4.1.1.1 Die produktive Infektion der Nerzzell LinieMvlLu 98
4.1.2 Die produktive Infektion von Zellen nicht humaner Primaten 99
4.1.3 Die produktive Infektion von humanen Zellen 101
4.1.3.1 PERVs adaptieren sich in vitro an humane Zellen 102
4.2 Keine Ãbertragung von PERV in vivo 109
4.3 Implikationen für die Xenotransplantation 115
5. ZUSAMMENFASSUNG U9
6. LITERATUR 121
7. ANHANG 139
7.1 Abkürzungen 139
7.2 Plasmidkarten 142
7.3 Danksagung 144
7.4 Lebenslauf. 146
7.5 Publikationen 147
7.6 Erklärung I51 |
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