Quantitativer Nachweis von Deoxynivalenol und Trichothecene-bildenden Fusarium spp. mit Biosensor und PCR in Getreide:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS.I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.IV
TABELLEN VERZEICHNIS.VI
ABKUERZUNGS VERZEICHNIS.VII
REGISTRIERTE HANDELSMARKEN.1.XII
1. ZIELSETZUNG.2
2. EINLEITUNG.5
2.1. ALLGEMEINE EINLEITUNG.5
2.1.1. MYKOTOXINE. 5
2.1.2. KONTAMINATION DES GETREIDES.8
2.1.3. FUSARIUM TOXINE.10
2.1.4. DIE GRUPPE DER TRICHOTHECEN MYKOTOXINE.13
2.1.5. CHARAKTERISIERUNG VON DEOXYNIVALENOL.7.16
2.1.5.1. EIGENSCHAFTEN.16
2.1.5.2. BIOCHEMISCHE WIRKUNG UND TOXIKOKINETIK.18
2.1.5.3. TOXIZITAET.19
2.2. NACHWEIS VON FUSARIUM-ARTEN.22
2.2.1. HERKOEMMLICHE ANALYSENMETHODEN. 22
2.2.2. DESOXYRIBONUKLEINSAEURE.24
2.2.2.1. WECHSELWIRKUNG VON NIEDERMOLEKULAREN SUBSTANZEN MIT DNA.25
2.2.3. DIE POLYMERASE KETTENREAKTION.26
2.2.4. ELEKTROPHORETISCHE METHODEN.29
2.2.5. QUANTIFIZIERUNG VON DNA.30
2.2.5.1. ABSORBTIONSMESSUNG.30
2.2.5.2. QUANTITATIVE PCR.30
2.2.5.3. QUANTITATIVE PCR FUER MYCOTOXIN-BILDENDE FUSARIUM-ARTEN.31
2.2.5.4. KINETISCHER VERLAUF EINER PCR-REAKTION.32
2.2.5.5. REAL-TIME-PCR UNTER VERWENDUNG VON FLUORESZENZMARKIERTEN OLIGO-
NUKLEOTIDEN.33
2.2.5.6. REAL-TIME-PCR UNTER VERWENDUNG VON FLUORESZENZFARBSTOFFEN.34
2.2.6. LIGHTCYCLER-SYSTEM.35
2.3. NACHWEIS VON DEOXYNIVALENOL.37
2.3.1. ALLGEMEINES.37
2.3.2. EXTRAKTION UND REINIGUNG. 38
2.3.3. TRENNUNG UND DETEKTION.39
2.3.3.1. PHYSIKALISCH-CHEMISCHE NACHWEISVERFAHREN.39
2.3.3.1.1. GASCHROMATOGRAPHIE.39
2.3.3.1.2. HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSHROMATOGRAPHIE.40
2.3.3.2. ALTERNATIVE VERFAHREN.42
2.3.3.2.1. DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE.42
2.3.3.2.2. IMMUNOLOGISCHE NACHWEISVERFAHREN.44
2.3.3.2.3. BIOSENSOREN. 46
2.3.3.2.4. THEORIE DES HETEROGENEN IMMUNOASSAYS.47
2.3.4. BIACORE-SYSTEM.50
2.3.4.1. EINFUEHRENDE BESCHREIBUNG DES PHAENOMENS DER SPR.50
2.3.4.2. GRUNDLAGEN DES BIACORE SYSTEMS.53
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
3. MATERIAL UND METHODEN.57
3.1. CHEMIKALIEN.57
3.2. MATERIAL UND GERAETE.59
3.3. PUFFER, MEDIEN UND LOESUNGEN.61
3.4. METHODEN.63
3.4.1. ALLGEMEINE METHODEN.63
3.4.1.1. STERILISATION.63
3.4.1.2. AGAROSEGELELEKTROPHORESE.63
3.4.1.3. ELUTION MITTELS "FREEZE SQUEEZE'-METHODE.64
3.4.2. METHODEN LIGHTCYCLER.64
3.4.2.1. PRAEPARATION DER PILZLICHEN DNA AUS REINKULTUREN UND AUS
GETREIDE.64
3.4.2.1.1. EXTRAKTION VON GESAMT-DNA AUS FUSARIUM SPP.64
3.4.2.1.2. DNA-EXTRAKTION AUS GETREIDEPROBEN.65
3.4.2.2. QUANTIFIZIERUNG DER STANDARD-DNA.66
3.4.2.3. TOX5-PRIMER.67
3.4.2.4. TOXHS PRIMER.68
3.4.2.5. PCR-PUFFER.69
3.4.2.6. PCR PROTOKOLL. 70
3.4.2.7. AUSWERTUNG DER MESSERGEBNISSE.71
3.4.2.7.1. METHODIK DER QUANTIFIZIERUNG.71
3.4.2.7.2. METHODIK DER IDENTIFIZIERUNG.73
3.4.3. METHODEN BIACORE. 74
3.4.3.1. ANTIKOERPER. 74
3.4.3.1.1. ANTIKOERPER GEGEN DEOXYNIVALENOL.74
3.4.3.1.2. ANTI-RABBIT-ANTIKOERPER.74
3.4.3.2. HERSTELLUNG EINES DEOXYNIVALENOL-BIOTIN KONJUGATS.74
3.4.3.3. REINIGUNG VON SYNTHESEPRODUKTEN MITTELS HPLC.75
3.4.3.4. KOPPLUNG DES DEOXYNIVALENOLDERIVATS AN BIOTIN.76
3.4.3.5. EXTRAKTION VON DON AUS GETREIDE.77
3.4.3.6. ALLGEMEINER MESSABLAUF IM BIACORE.78
3.4.3.7. MESSAUSWERTUNG.79
3.4.3. STATISTISCHE VALIDIERUNG.80
4. ERGEBNISSE.85
4.1. LIGHTCYCLER.85
4.1.1. ANPASSUNG DER PCR-REAKTION AN DEN LIGHTCYCLER.85
4.1.2. QUANTIFIZIERUNG EINES DNA-STANDARDS FUER DEN EINSATZ IM
LIGHTCYCLER.87
4.1.3. REPRODUZIERBARKEIT DER LIGHTCYCLER PCR.90
4.1.4. IDENTIFIZIERUNG DER PCR-PRODUKTE.91
4.1.5. ANALYSE VON FELDPROBEN.,1.92
4.2. BIACORE X.97
4.2.1. EICHKURVE EINER VERDUENNUNGSREIHE DES ANTI-DON-ANTIKOERPERS.97
4.2.2. EICHKURVE DER ANTIKOERPERBINDUNG EINER VERDUENNUNGSREIHE VON DON.98
4.2.3. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES DER EXTRAKTIONSDAUER UND DER
INKUBATIONSZEIT AUF DAS
SPR-SIGNAL. 99
4.2.4. VERWENDUNG EINES
SANDWICH-ASSAYS ZUR BESTIMMUNG VON DON.100
4.2.5. OPTIMIERUNG DES REGENERIERUNGSSCHRITTES DER SENSOROBERFLAECHE.101
4.2.6. OPTIMIERUNG DER PROBENEXTRAKTION FUER DEN EINSATZ IM BIACORE.106
4.2.7. SENSORSTABILITAET.108
4.2.8. UNTERSUCHUNG VON NATUERLICH KONTAMINIERTEN WEIZENPROBEN.108
INHALTSVERZEICHNIS
III
5. DISKUSSION.112
5.1. LIGHTCYCLER.112
5.1.1. DIE OPTIMIERUNG DER QUANTITATIVEN PCR.112
5.1.2. ANALYSE VON NATUERLICH UND KUENSTLICH KONTAMINIERTEN
GETREIDEPROBEN.114
5.1.3. EMPFEHLUNG FUER DIE DURCHFUEHRUNG EINER KONTAMINATIONSFREIEN
PCR.116
5.2. BIACOREX.117
5.2.1. BIOSENSOR FUER DEN DEOXYNIVALENOL-NACHWEIS.117
5.2.2. PROBENVORBEREITUNG.118
5.2.3. SYSTEMOPTIMIERUNG.:.119
5.2.4. REGENERIERBARKEIT DER SENSOROBERFLAECHE.120
5.2.5. ANWENDUNG DES BIOSENSORS.122
6. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK.125
7. SUMMARY.130
LITERATUR.XIII
DANKSAGUNG.XXXVIII |
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