Entwicklung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern zum Nachweis von Domoinsäure:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 EINFUEHRUNG.1
1.2 DOMOINSAEURE.3
1.2.1 KLASSIFIZIERUNG, VORKOMMEN UND WIRKUNG.:.3
1.2.2 BIOSYNTHESE UND EINFLUSSFAKTOREN AUF DIE DOMOINSAEUREPRODUKTION.4
1.2.3 DOMOINSAEURE-ANALYTIK.6
1.3 IMMUNOLOGISCHE METHODEN.8
1.3.1 STRUKTUR VON ANTIKOERPERN.8
1.3.2 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN.10
1.3.2.1 GEWINNUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN.11
1.3.2.2 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER.:.12
1.3.3 IMMUNOASSAYS.15
1.4 ZIELE.16
2 MATERIAL UND METHODEN.17
2.1 MATERIAL.17
2.1.1 ALLGEMEINE CHEMIKALIEN.17
2.1.2 IMMUNREAGENZIEN.18
2.1.3 CHROMATOGRAPHIEREAGENZIEN.,.18
2.1.4 ZELLKULTURMEDIEN.18
2.1.5 PUFFERLOESUNGEN.20
2.1.6 VERBRAUCHSMATERIAL.23
2.1.7 GERAETE UND SONSTIGE BEDARFSGEGENSTAENDE.23
2.2 METHODEN.25
2.2.1 SYNTHESE UND CHARAKTERISIERUNG VON
DOMOINSAEURE-PROTEIN-KONJUGATEN.25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.2.1.1 KONJUGAT-SYNTHESE.25
2.2.1.2 KONJUGAT-CHARAKTERISIERUNG.27
2.2.2 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER.28
2.2.3 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER.30
2.2.3.1 IMMUNISIERUNG.30
2.2.3.2 ZELLFUSION.32
2.2.3.3 HAZ-SELEKTION.33
2.2.3.4 KLONIEREN VON HYBRIDOMZELLEN.33
22
.
3.5
SCREENING VON ANTI-DO ANTIKOERPERN PRODUZIERENDEN ZELLLINIEN.34
2.2.3.OE CRYOKONSERVIERUNG UND AUFTAUEN VON ZELLEN.TR.37
2
.
2
.
3.1
MASSENPRODUKTION VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.38
2.2.3.8 SUBKLASSENBESTIMMUNG.40
22
.
3.9
AUFREINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.41
2.2.3.10 BESTIMMUNG DER IMMUNGLOBULINKONZENTRATION.43
2.2.4 ENTWICKLUNG EINES KOMPETITIVEN ELISA.45
2.2.5 ENTWICKLUNG EINES KOMPETITIVEN ELISA MIT VERSTAERKERSYSTEM.47
2.2.6 BERECHNUNG DER DOMOINSAEUTFEKONZENTRATIONEN.50
2.2.7 BESTIMMUNG VON KREUZREAKTIVITAETEN.51
2.2.8 PROBENMESSUNG.53
2.2.8.1 PROBENAUFBEREITUNG.
R
.53
2.2.8.2 METHANOL-KOMPATIBILITAET DES MAK 4D1D.54
2.2.8.3 WIEDERFINDUNGSRATEN VON DO IM ELISA.54
2.2.8.4 PROBENAUFSTOCKUNG.54
2.2.9 MESSUNG IM BIACORE.55
2.2.9.1 GRUNDLAGEN.55
2.2.9.2 MESSABLAUF.56
INHALTSVERZEICHNIS
III
3 ERGEBNISSE.59
3.1 KONJUGATSYNTHESE UND CHARAKTERISIERUNG.59
3.2 POLYKLONALE ANTIKOERPER.62
3.2.1 IMMUNISIERUNG UND SERUMGEWINNUNG.62
3.2.2 DO-ENZYMIMMUNOASSAY MIT POLYKLONALEN ANTIKOERPERN.64
3.2.2.1 ENTWICKLUNG EINES STANDARD-ELISA.64
3.2.2.2 DO-ENZYMIMMUNOASSAY MIT AMPLIFIZIERUNGSSYSTEM.65
3.2.3 BESTIMMUNG VON KREUZREAKTIVITAETEN.66
3.3 ENTWICKLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN DOMOINSAEURE.67
3.3.1 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN MIT KLH-DO.5.67
3.3.2 ZELLFUSION.70
3.3.3 SCREENING DER ZELLKULTURUEBERSTAENDE.70
3.4 ENTWICKLUNG EINES ENZYMIMMUNOASSAYS ZUM NACHWEIS VON DOMOINSAEURE.72
3.4.1 BESTIMMUNG DER IMMUNGLOBULINSUBKLASSE.74
3.4.2 MASSENPRODUKTION MONOKLONALER ANTIKOERPER.74
3.4.3 REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON ANTIKOERPERN.77
3.5 STANDARDISIERUNG UND OPTIMIERUNG EINES ENZYMIMMUNOASSAY ZUM NACHWEIS
VON
DOMOINSAEURE MIT MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.79
3.5.1 DO-ELISA MIT AMPLIFIZIERUNGSSYSTEM.80
3.5.2 BESTIMMUNG DER KREUZREAKTIVITAETEN DES MAK 4D1D.81
3.6 PROBENMESSUNG.82
3.6.1 METHANOL-KOMPATIBILITAET DES MAK 4D1D.82
3.6.2 ERMITTLUNG VON WIEDERFINDUNGSRATEN.83
3.6.3 BESTIMMUNG DER DO-KONZENTRATION VON EXPONIERTEN MUSCHELN.84
3.6.4 REALPROBENMESSUNG.86
3.7 BIACORE-MESSUNGEN.86
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.7.1 BESTIMMUNG DER AFFINITAETSKONSTANTEN MIT DEM BIACORE 3000.86
3.7.2 KOMPETITIVER BIACORE-IMMUNOASSAY.89
3.7.3 KREUZREAKTIVITAETSSTUDIEN MIT DEM BIACORE 3000 UND
CHIPREGENERRATION.91
4 DISKUSSION.93
4.1 KONJUGATSYNTHESE UND -CHARAKTERISIERUNG.93
4.2 IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN UND MAEUSEN.95
4.3 POLYKLONALE ANTIKOERPER.97
4.4 MONOKLONALE ANTIKOERPER.97
4.4.1 ZELLFUSION UND ZELLKULTUR.97
4.4.2 MASSENPRODUKTION UND AUFREINIGUNG.:R.99
4.5 ENTWICKLUNG EINES DO-ENZYMIMMUNOASSAYS.101
4.6 PROBENMESSUNG.104
4.7 UNTERSUCHUNG DER ANTIKOERPER-ANTIGEN-INTERAKTIONEN.106
4.8 AUSBLICK.107
5 ZUSAMMENFASSUNG.109
6 LITERATUR
111 |
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