Konstruktion von scFv-, Fab- und enzymkonjugierten Antikörperfragmenten für die Umweltanalytik:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2002
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VERZEICHNISSE
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG.1
II MATERIAL UND METHODEN.14
1 MATERIAL.14
1.1 REAGENZIEN.14
1.2 IMMUNREAGENZIEN.16
1.3 PROBENPUFFER, DNA- UND PROTEINMARKER.16
1.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE REAGENZIEN.16
1.5 KLONIERUNGSMATERIAL UND BAKTERIENSTAEMME.17
1.6 PYRETHROIDE, S-TRIAZINE UND DEREN KONJUGATE.18
1.7 OLIGONUKLEOTIDPRIMER.19
1.8 MEDIEN UND PUFFER. 21
1.8.1 ZELLKULTURMEDIUM.21
1.8.2 MEDIEN UND AGAR ZUR BAKTERIENKULTUR.21
1.8.3 PUFFERLOESUNGEN FUER ELISA.,.23
1.8.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND WESTEMBLOT.25
1.8.5 DNA-GELELEKTROPHORESE.26
1.8.6 STREPTAVIDIN-AFFNITAETSCHROMATOGRAPHIE.26
1.8.7 PUFFER FUER BIACORE-MESSUNGEN.26
1.9 VERBRAUCHSMATERIAL.27
1.10 GERAETE.27
2 METHODEN.29
2.1 KONSTRUKTION EINES PYRETHROID-SPEZIFISCHEN
SCFV-ANTIKOERPERFRAGMENTS.29
2.1.1 SCFV PHAGEN-SYSTEM.29
2.1.1.1 ISOLIERUNG VON MRNA.33
2.1.1.2 SYNTHESE DER ERSTSTRANG-CDNA.35
2.1.1.3 SELEKTIVE AMPLIFIKATION DER VL- UND VN-REGIONEN.36
2.1.1.4 KONJUGATION DER
VL- UND VN-REGIONEN MIT DNA-LINKER.37
2.1.1.5 RV VON SCFV UND PCANTAB 5E.39
2.1.1.6 LIGATION VON SCFV-DNA MIT DEM EXPRESSIONSVEKTOR PCANTAB 5E.41
2.1.1.7 TRANSFORMATION VON TG 1 BAKTERIEN MIT PCANTAB 5E/SCFV.41
2.1.1.8 RETTUNG DES REKOMBINANTEN PCANTAB 5E PHAGEMIDS.43
2.1.1.9 PRAEPARATION VON PHAGENPARTIKELN ZUR SELEKTION.44
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/965100979
VERZEICHNISSE
2.1.1.10 SELEKTION ANTIGENSPEZIFISCHER PHAGEN UEBER
PANNING.45
2.1.1.11 REINFEKTION DER TG 1 -BAKTERIENZELLEN MIT SELEKTIERTEN
PHAGENPARTIKELN.47
2.1.1.12
SCREENING DER SELEKTIERTEN PHAGENFRAKTION.47
2.1.2 SEQUENZANALYSE DER POSITIVEN KLONE.49
2.1.2.1 KONSTRUKTION DES SCFV DER MYELOMA-ZELLINIE PAI-BJAG81.51
2.1.2.2 SEQUENZANALYSE.51
2.1.2.3 DATENBANKANALYSE.52
2.1.3
OLIGONUCLEOTIDE SITE-DIRECTED MUTAGENESE NACH KUNKEL.52
2.1.3.1 EINZELSTRANG-DNA-ISOLIERUNG.53
2.1.3.2 OLIGONUCLEOTIDE SITE-DIRECTED MUTAGENESE.54
2.1.4 CHARAKTERISIERUNG DES SCFV MIT SDS-PAGE UND WESTEMBLOT.56
2.1.4.1 AUFBEREITUNG DER PROBEN.56
2.1.4.2 SDS-PAGE VON SCFV. 57
2.1.4.3 WESTEMBLOT VON SCFV.58
2.2 KONSTRUKTION VON S-TRIAZIN-SPEZIFISCHEN F
AB-ANTIKOERPERFRAGMENTEN.58
2.2.1 SUBKLONIERUNG DER VARIABLEN ANTIKOERPERREGIONEN IN PASK99.60
2.2.1.1 AMPLIFIKATION DER VARIABLEN REGIONEN DES SCFV.62
2.2.1.2 RV UND LIGATION DER VARIABLEN REGIONEN MIT PASK99.64
2.2.1.3 LIGATION DER SCHWER- UND LEICHTKETTEN IN PASK99.67
2.2.2 BAKTERIELLE EXPRESSION DER F
AB-VARIANTEN IN PASK99.67
2.2.3
SCREENING DER EXPRIMIERTEN FAB-ANTIKOEPER.68
2.2.4 F
AB-ENZYMIMMUNOASAY.69
2.2.4.1 AUSWERTUNG DES F
AB-ENZYMIMMUNOASSAY.71
2.2.5 REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG DER EXPRIMIERTEN F
AB-FRAGMENTE.72
2.2.5.1 STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.73
2.2.5.2 CHARAKTERISIERUNG DER GEREINIGTEN F
AB-VARIANTEN IM ELISA UND UEBER SDS-
PAGE.73
2.2.5.3 KONZENTRIERUNG DER F
AB-FRAGMENTE.73
2.2.5.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG IM BCA-TEST.74
2.2.6 F
AB-CHARAKTERISIERUNG MIT BIACORE BIOSENSOR.74
2.2.6.1 PRAEPARATION DES SENSORCHIPS.75
2.2.6.2 ERMITTLUNG DER AFFINITAETSDATEN DER F
AB-ANTIKOERPER.75
N
VERZEICHNISSE
2.3 KONSTRUKTION DES SCFV(K47H)-AP FUSIONSPROTEINS.76
2.3.1 DIE KLONIERUNG DER AP IN PASK75.77
2.3.1.1 AUFBEREITUNG VON PASK75 FUER DIE LIGATION.77
2.3.1.2 AMPLIFIKATION DES AP-GENS AUS PPHOA4.78
2.3.1.3 LIGATION DER AP MIT PASK75.80
2.3.2 KLONIERUNG DES SCFV-FRAGMENTS.81
2.3.2.1 AMPLIFIKATION VON SCFV AUS PCANTAB 5E.81
2.3.2.2 AUFBEREITUNG DES VEKTORS PASK75/AP.82
2.3.2.3 LIGATION VON PASK75/AP UND SCFV(K47H).82
2.3.3 EXPRESSION UND
SCREENING.83
2.3.4 AUFREINIGUNG DES FUSIONSPROTEINS.84
2.3.4.1 STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.84
2.3.4.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MIT ATRAZIN. 85
2.3.5 WESTEMBLOT ZUR PROTEINCHARAKTERISIERUNG.85
2.3.6 SCFV(K47H)-AP-ENZYMIMMUNOASSAY.86
2.3.6.1 AUSWERTUNG DES SCFV-AP-ENZYMIMMUNOASSAYS.86
2.3.6.2 BESTIMMUNG DER KREUZREAKTIVITAET.86
DI ERGEBNISSE.89
1 KONSTRUKTION EINES PYRETHROID-SPEZIFISCHEN SCFV-ANTIKOERPERFRAGMENTS.89
1.1 SCFV PHAGEN-SYSTEM.89
1.1.1 SELEKTIVE AMPLIFIKATION DER
VH UND VL REGIONEN.90
1.1.2 AMPLIFIKATION DES DNA-LINKERS.93
1.1.3 KONJUGATION DER
VH-
UND VL-REGIONEN MIT DEM LINKERFRAGMENT.94
1.1.4 LIGATION VON SCFV MIT PCANTAB 5E.96
1.1.5 ISOLATION DES REKOMBINANTEN PCANTAB 5E PHAGEMIDS.98
1.1.5.1 PRAEPARATION UND ANTIGENSPEZIFISCHE SELEKTION DER
PHAGENPAERTIKEL.99
1.1.5.2 REINFEKTION VON TG 1 -BAKTERIENZELLEN MIT DEN SELEKTIERTEN
PHAGENPARTIKELN.100
1.1.6 EXPRESSION UND
SCREENING VON LOESLICHEN SCFV DER SELEKTIERTEN
PHAGENFRAKTION.101
1.2 DNA-ANALYSE DER POSITIVEN KLONE.103
1.2.1 KONSTRUKTION DES SCFV DER MYELOMA-ZELLINIE PAI-BJAG81.104
1.2.2 SEQUENZANALYSE.106
M
VERZEICHNISSE
1.2.3 DATENBANKANALYSE.107
1.3
OLIGONUCLEOTIDE SITE-DIRECTED MUTAGENESE NACH KUNKEL.110
1.4 CHARAKTERISIERUNG DER MUTIERTEN PYRETHROID-SPEZIFISCHEN
SCFV-KLONE.114
1.4.1 ANALYSE DES SCFV IM ELISA.114
1.4.2 CHARAKTERISIERUNG DES SCFV MIT POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE UND
WESTEMBLOT.H6
2 KONSTRUKTION VON 5-TRIAZIN-SPEZIFISCHEN F
AB-ANTIKOERPERFRAGMENTEN.118
2.1 PCR-AMPLIFIKATION DER VARIABLEN REGIONEN VON SCFV AUS PCANTAB 5E.119
2.2 LIGATION VON V
H UND VL MIT DEM VEKTOR PASK99.122
2.3 LIGATION DER SCHWER- UND LEICHTKETTEN-FRAGMENTE MIT PASK99.125
2.4 BAKTERIELLE EXPRESSION UND
SCREENING DER FAB-ANTIKOERPERFFAGMENTE.129
2.5 F
AB-ENZYMIMMUNOASSAY. 131
2.6 REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG DER EXPRIMIERTEN FAB-FRAGMENTE.133
2.7 CHARAKTERISIERUNG DER F
AB-KINETIK IM BIACORE BIOSENSOR.136
3 KONSTRUKTION DES SCFV(K47H)-AP FUSIONSPROTEINS.138
3.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE.'.138
3.2 AUFBEREITUNG DES VEKTORS PASK75.139
3.3 AMPLIFIKATION DER AP.141
3.4 LIGATION DER AP MIT PASK75.142
3.5 AMPLIFIKATION DES SCFV-FRAGMENTS.144
3.6 PRAEPARATION DES VEKTORS PASK75/AP.146
3.7 LIGATION VON SCFV(K47H) MIT PASK75/AP.146
3.8 EXPRESSION UND
SCREENING VON SCFV(K47H)-AP.147
3.9 AUFREINIGUNG VON SCFV(K47H)-AP.150
3.9.1 STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.150
3.9.2 ATRAZIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE. 150
3.10 CHARAKTERISIERUNG VON SCFV-AP.151
3.10.1 WESTEMBLOT MIT SCFV-AP.151
3.10.2 SCFV(K47H)-AP-ENZYMIMMUNOASSAY.152
3.10.3 BESTIMMUNG DER KREUZREAKTIVITAET VON SCFV-AP.153
IV DISKUSSION.154
1 KONSTRUKTION VON PYRETHROID-SPEZIFISCHEN SCFV-ANTIKOERPERFRAGMENTEN.154
2 KONSTRUKTION VON S-TRIAZIN-SPEZIFISCHEN F
AB-ANTIKOERPERFRAGMENTEN.164
IV
VERZEICHNISSE
3 SCFV(K47H)-AP FUSIONSPROTEIN.175
V ZUSAMMENFASSUNG.192
VI LITERATUR.195
VH ANHANG.219
V |
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