Wegener'sche Granulomatose: Untersuchungen zur Rolle zytoplasmatischer Neutrophilen-Autoantikörper und deren Zielantigen Proteinase 3 sowie Neutrophilen-Elastase bei Entzündungsprozessen in der Maus
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2002
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INHALT
SUMMARY.X
ZUSAMMENFASSUNG.XIII
1 EINLEITUNG.1
1.1 KLASSIFIZIERUNG SYSTEMISCHER IDIOPATHISCHER VASKULITIDEN.1
1.2
ANTINEUTROPHILE ZYTOPLASMATISCHE AUTOANTIKOERPER (ANCA)
.2
1.3 WEGENER'SCHE GRANULOMATOSE.4
1.4 C-ANCA IN DER WEGENER'SCHEN GRANULOMATOSE
.6
1.5 WEGENER'S AUTOANTIGEN: PROTEINASE 3.9
L .6
GEWINNUNG FUNKTIONELLER, REKOMBINANTER PROTEINE AUS E. COLI.12
1.7 DIE ARTHUS-REAKTION.15
1.8 ZIELSETZUNG.16
2 MATERIAL.17
2.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME.17
2.2 GERAETE.17
2.3 BAKTERIENSTAEMME.18
2.4 MAUSSTAEMME.18
2.5 REKOMBINANTE PLASMIDE UND VEKTOREN.18
2.6 OLIGONUKLEOTIDE.:.19
3 METHODEN.21
3.1 PLASMIDISOLIERUNG AUS
E. COLI [26].21
3.2 DNA-AMPLIFIZIERUNG (PCR).21
3.3 DNA-RESTRIKTIONSVERDAU.21
3.4 HORIZONTALE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.22
3.5 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN.22
3.6 BESTIMMUNG VON DNA-KONZENTRATIONEN.22
3.7 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.22
3.8 KLONIERUNG DER EXPRESSIONSKONSTRUKTE.23
3.9 DNA-TRANSFORMATION.23
3.9.1 CACH-VERMITTELTE TRANSFORMATION [62, 69]
.23
3.9.2 ELEKTROTRANSFORMATION [136, 84]
.24
3.10 DNA-SEQUENZANALYSE.24
3.11 REKOMBINANTE PROTEINEXPRESSION IN
E. COLI.24
3.11.1 ISOLATION DER EINSCHLUSSKOERPERCHEN (YY INCLUSION HODY
"-PRAPARATION)
.25
3.11.2 SOLUBILISIERUNG DER PROTEINAGGREGATE
.25
-VI-
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/967128293
INHALT
3.11.3 RENATURIERUNG VON SOLUBILISIERTEM PROTEIN
.26
3.11.4 REINIGUNG VON RENATURIERTER RMPR3 UEBER FPLC
.21
3.11.5 AKTIVIERUNG VON RMPR3
.27
3.12 GROESSEN BESTIMMUNG VON PROTEINEN DURCH
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE (SDS-
PAGE) .
27
3.13 PROTEINDETEKTION.28
3.13.1 PROTEINFAERBUNG MIT COOMASSIE-BRILLIANT-BLUE [100, 209, 340]
.28
3.13.2 PROTEINFAERBUNG MIT SILBERNITRAT [28]
.28
3.13.3 WESTERN-BLOT ANALYSE VON PROTEINEN [318, 39]
.29
3.14 PROTEINSEQUENZIERUNG [85].30
3.15 COLORIMETRISCHE PROTEINQUANTIFIZIERUNG [234].30
3.16 SPEKTROPHOTOMETRISCHE PROTEINQUANTIFIZIERUNG [189].30
3.17 BESTIMMUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET VON REKOMBINANTER MPR3.31
3.1
8 KOVALENTE KOPPLUNG VON HNE AN CYANOGENBROMID-AKTIVIERTE SEPHAROSE.31
3.19 STRUKTURMODELLIERUNG VON MPR3.31
3.20 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN.32
3.20.1 TIERHALTUNG
.32
3.20.2 GENETISCHE CHARAKTERISIERUNG VON ZUCHTMAEUSEN
.32
3.21 HERSTELLUNG POLYKLONALER MPR3-ANTISEREN
RN PR3/NE-DEFIZIENTEN MAEUSEN.34
3.21.1 IMMUNISIERUNG
.34
3.21.2 HERSTELLUNG VON SERUM
.35
3.22 PASSIVE IMMUNISIERUNG VON WILDTYP-MAEUSEN.35
3.23 BLUTBILDANALYSE.35
3.24 GEWINNUNG VON NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN AUS DER PERITONEALHOEHLE.36
3.24.1 GEWINNUNG VON PERITONEALZELLEN
.35
3.24.2 ISOLATION VON NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN AUS PERITONEALFLUESSIGKEIT
[90]
.37
3.24.3 HERSTELLUNG EINES LYSATS VON NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN FUER DEN
WESTERN BLOT
.37
3.25
FESTPHASENIMMUNOASSAY ("ELISA", "ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY",
[91]).37
3.26 OEURCHFLUSSZYTOMETRIE.38
3.26.1 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE IDENTIFIKATION VON NEUTROPHILEN
GRANULOZYTEN
.39
3.26.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE DETEKTION VON MEMBRANSTAENDIGER PR3 AUF
PARTIELL STIMULIERTEN
NEUTROPHILEN
.3 Y
3.26.3 QUANTITATIVE ANALYSE DER PHAGOZYTOSEKAPAZITAET VON NEUTROPHILEN
GRANULOZYTEN IN VOLLBLUT .40
3.27 REVERSE PASSIVE ARTHUS-REAKTION (RPA, [4]).40
3.27.1 REVERSE PASSIVE ARTHUS-REAKTION IN DER HAUT
.41
3.27.2 REVERSE PASSIVE ARTHUS-REAKTION IN DER PERITONEALHOEHLE
.41
-VII-
INHALT
3.28 INDUKTION EINER LOKALEN INFLAMMATORISCHEN REAKTION IN DER HAUT
DURCH INJEKTION VON
TNFA .41
3.29 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON
TNFA.42
3.30 TRANSFER VON KNOCHENMARKSZELLEN OVALBUMIN-IMMUNISIERTER
NE/PR3-DEFIZIENTER
MAEUSE 42
3.30.1 IMMUNISIERUNG VON SPENDERMAEUSEN MIT
ALUMINIUMHYDROXID-ADSORBIERTEM OVALBUMIN.
43
3.30.2 ISOLATION VON KNOCHENMARKSZELLEN UND TRANSFER AUF NAIVE MAEUSE
.
43
3.30.3 QUANTIFIZIERUNG SPEZIFISCHER IMMUNGLOBULIN-SEZERNIERENDER
PLASMAZELLEN (YYELISPOT",
ENZYME LINKED IMMUNOSPOT ASSAY [68, 278])
.
43
3.31 HERSTELLUNG VON ORGAN- UND HAUTPRAEPARATEN FUER HISTOLOGISCHE
ANALYSEN.44
3.31.1 ORGANENTNAHME UND FIXIERUNG.
45
3.31.2 HERSTELLUNG VON GEFRIERSCHNITTEN
.
45
3.31.3 FAERBUNG VON GEFRIERSCHNITTEN MIT HAEMALAUN/EOSIN
.
45
3.32 DETEKTION VON ANTI-NEUTROPHILEN-ANTIKOERPERN MIT HILFE INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG [345].46
3.33 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES AKTIVIERUNGSZUSTANDES NEUTROPHILER
GRANULOZYTEN . 46
3.33.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG INTRAZELLULAERER, OXIDATIVER
SAUERSTOFFVERBINDUNGEN.
47
3.33.2 QUANTITATIVE BESTIMMUNG FREIGESETZTEN SUPEROXIDS [206]
.
47
3.34 STATISTISCHE AUSWERTUNG.47
4 ERGEBNISSE.49
4.1 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG PR3/NE-DEFIZIENTER MAEUSE.49
4.1.1 BESTIMMUNG DER ANZAHL VON NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN IN PERIPHEREM
BLUT.
50
4.2 VERGLEICHENDE, QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER PHAGOZYTOSELEISTUNG
NEUTROPHILER
GRANULOZYTEN VON WILDTYP- UND PR3/NE-DEFIZIENTEN MAEUSEN.51
4.3 REVERSE, PASSIVE ARTHUS-REAKTION.55
4.3.1 REVERSE, PASSIVE ARTHUS-REAKTION IN DER HAUT
.
55
4.3.2 IMMUNKOMPLEXPERITONITIS
.
59
4.4 HERSTELLUNG REKOMBINANTER MPR3.61
4.4.1 REKOMBINANTE EXPRESSION VON PRO-MPR3 IN E. COLI
.
61
4.4.2 SOLUBILISIERUNG UND RENATURIERUNG VON PRO-RMPR3
.
66
4.4.3 KONVERTIERUNG VON PRO-RMPR3 ZU KATALYTISCH AKTIVER RMPR3.
68
4.5 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PRO-RMPR3 BZW. RMPR3.70
4.5.1 KONVERTIERTE PRO-RMPR3 IST KATALYTISCH AKTIV
.
70
4.5.2 PRO-RMPR3 UND RMPR3 WIRD VON HUMANER NEUTROPHILEN-ELASTASE
GESPALTEN.
71
4.6 GENERIERUNG EINES MPR3-ANTIKOERPERSPIEGELS IN WILDTYP-MAEUSEN.76
4.6.1 IMMUNISIERUNG VON PR3/NE-DEFIZIENTEN MAEUSEN MIT RMPR3
.
76
- VIII-
INHALT
4.6.2 BESTIMMUNG DER SPEZIFITAET DES GEWONNENEN ANTISERUMS
.
78
4.6.3 IGG AUS PRO-RMPR3- UND RMPR3-ANTISERUM BINDEN AN
OBERFLAECHENEXPONIERTE PR3-
EPITOPE
.
81
4.6.4 PRO-RMPR3-ANTISERUM INDUZIERT KEINEN NACHWEISBAREN
"OXIDATIVEN HURST" NEUTROPHILER
GRANULOZYTEN
.
83
4.6.5 UEBERTRAGUNG DER ANTI-MPR3-IMMUNITAET VON PR3/NE-DEFIZIENTEN MAEUSEN
AUFKONGENE WILDTYP-
TIERE .
86
4.7 MURINE C-ANCA (MC-ANCA) VERSTAERKEN EINE LOKALE ENTZUENDUNGSREAKTION
IN DER HAUT .
.93
5 DISKUSSION.98
5.1 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG PR3/NE-DEFIZIENTER MAEUSE.98
5.2 REVERSE, PASSIVE ARTHUS-REAKTION IN DER HAUT.101
5.3 IMMUNKOMPLEXPERITONITIS.103
5.4 REKOMBINANTE EXPRESSION VON MPR3.105
5.5 IN PR3/NE-DEFIZIENTEN MAEUSEN LASSEN SICH MURINE
C-ANCA GENERIEREN.114
5.6 SYSTEMISCH VERABREICHTE MC-ANCA-SEREN INDUZIEREN TN WILDTYP-MAEUSEN
KEINE
SYMPTOME DER WEGENER'SCHEN TRIAS.116
5.7
MC-ANCA VERSTAERKEN EINE LOKALE ENTZUENDUNGSREAKTION.122
5.8
AUSBLICK.123
6 LITERATUR.125
7 ABKUERZUNGEN UND CHEMISCHE FORMELN.146
8 ANHANG.150
-IX- |
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| title_full | Wegener'sche Granulomatose Untersuchungen zur Rolle zytoplasmatischer Neutrophilen-Autoantikörper und deren Zielantigen Proteinase 3 sowie Neutrophilen-Elastase bei Entzündungsprozessen in der Maus von Heiko Pfister |
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| title_short | Wegener'sche Granulomatose |
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