Untersuchungen zur Funktion des Regulatorproteins SlyA in enteroinvasiven Escherichia coli und in Salmonella typhimurium:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German English |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2002 |
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG. J
SUMMARY.
2
1. EINLEITUNG
3
1.1. INFEKTIONSERREGER DES GASTROINTESTINALTRAKTES.
3
1.2. BEISPIELE FUER GASTROINTESTINALE INFEKTIONSERREGER.
5
1.2.1. DER INFEKTIONSZYKLUS VON
SALMONELLA SPP.
5
1.2.2. VLRULENZFAKTOREN VON S. TYPHIMURIUM.
8
1.2.3. INFEKTIONEN MIT
SHIGELLA FLEXNERI UND ENTEROINVASIVEN ESCHERICHIA COLI.10
1.2.4. VIRULENZFAKTOREN VON SJFEXNM.
12
1.3. DER TRANSKRIPTIONSREGULATOR SLYA.
14
1.3.1. IDENTIFIZIERUNG VON
SLYA AUS S. TYPHIMURIUM.14
1.3.2. REGULATION VON HLYE DURCH SLYA.1
5
1.3.3. SLYA-HOMOLOGE PROTEINE.16
1.3.4. FUNKTIONEN VON SLYA.18
ZIELSETZUNG.
19
2. MATERIAL 20
2.1. BAKTERIENKULTUR.20
2.1.1. BAKTERIENSTAEMME.20
2.
1
.
2
. MEDIEN FUER DIE BAKTERIENKULTUR.21
2.2. ZELLKULTUR.21
2.2.1. ZELLINIEN.21
2.2.2. PRIMAERE ZELLEN.21
2.2.3. PUFFER UND MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR.21
2.2.4. PUFFER UND LOESUNGEN ZUR ANFERTIGUNG ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER
PRAEPARATE.22
2.3. PROTEINISOLIERUNG.22
2.3.1. PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE ISOLIERUNG VON
GESAMTZELLPROTEINEXTRAKTEN.22
2.3.2. PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG (IEF).23
2.3.3. PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE
SDS-POLYACIYLAMID-GELELEKTROPHORESE.23
2.4. NUKLEOTIDE UND OLIGONUKLEOTIDE.24
2.4.1. NUKLEOTIDE.24
2.4.2. OLIGONUKLEOTIDE.24
2.5. PLASMIDE UND VEKTOREN.25
2.6. SONSTIGE PUFFER UND LOESUNGEN.25
2.7. VERBRAUCHSMATERIALIEN.26
2.7.1. CHEMIKALIEN UND ENZYME.26
2.7.2. ANTIBIOTIKA.26
2.8. GERAETE.26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3. METHODEN
28
3.1. HALTUNG UND AUFZUCHT VON BAKTERIEN. 28
3.1.1. HERSTELLEN EINER FLUESSIGKULTUR. 28
3.1.2. HERSTELLEN EINER GLYCERINKULTUR. 28
3.2. ALLGEMEINE MOLEKULARGENETISCHE METHODEN. 28
3.2.1. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA. 28
3.2.1.1. MIDIPRAEPARATION - ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM MITTLEREN
MASSSTAB.28
3.2.1.2. MINIPRAEPARATION - ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM KLEINEN
MASSSTAB. 29
3.2.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA. 29
3.2.3. SPALTUNG VON DNA MIT HILFE VON RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.29
3.2.4. AMPLIFIZIERUNG VON DNA MITTELS POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).30
3.2.5. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN IM
AGAROSEGEL.31
3.2.6. TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA.
3
J
3.2.6.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN VON
E. COLI, S. TYPHIMURIUM UND
S. TYPHI.
3-2.6.2. TRANSFONNATION KOMPETENTER
E. COLI, S. TYPHIMURIUM UND S. TYPHI. 31
3.2.7. KONJUGATION.
3.3. PROTEINISOLIERUNG.
3.3.1. ISOLIERUNG VON GESAMTZELLPROTEINEN AUS
E COLI, S. TYPHIMURIUM UND S. TYPHI.32
3.3.2. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION MIT DEM
BIO-RAD-PROTEIN-ASSAY.32
3.3.3. FAELLUNG VON PROTEINEN MIT TRICHLORESSIGSAEURE (TCA).32
3.4. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTMPHNRE.SE.
32
3.4.1. AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IN DER ERSTEN DIMENSION DURCH
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG (IEF) IN ROEHRCHENGELEN.32
3.4.2. AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IN DER ZWEITEN DIMENSION DURCH
SDS-POLYACIYL-
AMID-GELELEKTROPHORESE.
34
3.4.3. FAERBUNG VON PROTEINEN MIT SILBEMITRAT.
35
3.4.4. FAERBUNG VON PROTEINEN MIT KOLLOIDALEM COOMASSIE-BLAU.
35
3.5. ZELLKULTUR.
3.5.1. ZELLKULTUR MIT PERMANENTEN ZELLINIEN.36
3.5.1.1. PASSAGIEREN VON CACO-2 ZELLEN UND J774A. 1 -MAKROPHAGEN.36
3.5.1.2. AUSSAEEN VON J774A. 1 -MAKROPHAGEN NACH TYPANBLAUFAERBUNG.36
3.5.
1
.3. INFEKTION VON J774A. 1-MAKROPHAGEN MIT ENTEROINVASIVEN E COLI.
37
3.5.1.4. GIEMSA-FAERBUNG INFIZIERTER J774A.1-MAKROPHAGEN.
37
3.5.1.5. HERSTELLUNG ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER PRAEPARATE NACH INFEKTION
VON J774A.1-MAKROPHAGEN.38
3.5.1.6. MIKROINJEKTION.38
3.5.1.7. NACHWEIS VON APOPTOSE UND NEKROSE.
39
3.5.2. ZELLKULTUR MIT PRIMAEREN ZELLEN.
39
3.5.2.1. GEWINNUNG VON HUMANEN DENDRITISCHEN VORLAEUFERZELLEN.39
3.5.2.2. INFEKTION VON DENDRITISCHEN VORLAEUFERZELLEN MIT ENTEROINVASIVEN
E. COLI.
39
4. ERGEBNISSE
41
4.1. ANALYSE DER PROTEINEXPRESSIONSMUSTER VON EIEC 12860 IN ANWESENHEIT
BEZIEHUNGS
WEISE IN ABWESENHEIT DES REGULATORPROTEINS SLYA.42
4.1.1. KONSTRUKTION DES SLYA-UEBEREXPRIMIERENDEN STAMMES EIEC 12860/PAL
105.42
4.1.2. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE MIT PROTEINEXTRAKTEN DER
STAEMME
EIEC 12860 UND EIEC 12860S/ A.43
4.1.3. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE MIT PROTEINEXTRAKTEN DES
SLYA-UEBER-
EXPRIMIERENDEN STAMMES EIEC 12860/PAL 105.44
4.1.4. MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSEN ZUR IDENTIFIZIERUNG DER IN
ABHAENGIGKEIT
VON SLYA DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN PROTEINE AUS EIEC 12860.45
4.2. ANALYSE VON EIEC 12860, EIEC 12860/PAL105 UND EIEC 1286QRIYA NACH
WACHS
TUM UNTER STRESSBEDINGUNGEN.49
4.2.1. WACHSTUMSVERHALTEN VON EIEC 12860, EIEC 12860/PAL 105 UND
EIEC 1286QS7YA BEI ERHOEHTEN TEMPERATUREN.49
4.2.2. WACHSTUMSVEIHALTEN VON EIEC 12860, EIEC 12860/PAL 105 UND
EIEC 12860S/YA BEI ERNIEDRIGTEN PH-WERTEN.51
4.2.3. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE MIT PROTEINEXTRAKTEN DER
STAEMME
EIEC 12860 UND EIEC 12860S/YA NACH KULTIVIERUNG DER BAKTERIEN BEI
ERNIEDRIGTEN PH-WERTEN.54
4.3. ANALYSE DER PROTEINEXPRESSIONSMUSTER VON S. TYPHIMURIUM ATCC 14028S
IN AN
WESENHEIT BZW. IN ABWESENHEIT DES REGULATORPROTEINS SLYA.55
4.3.1. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE MIT PROTEINEXTRAKTEN DER
STAEMME
S. TYPHIMURIUM ATCC
14028S/PAL102,S. TYPHIMURIUM ATCC 14028S
UND
S. TYPHIMURIUM ATCC 14028S/YA.55
4.3.2. MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSEN ZUR IDENTIFIZIERUNG DER IN
ABHAENGIGKEIT VON
SLYA DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN PROTEINE AUS S. TYPHIMURIUM ATCC
14028S.57
4.4. ANALYSE DER PROTEINEXPRESSIONSMUSTER VON S. TYPHI TY514S IN
ANWESENHEIT BZW. IN
ABWESENHEIT DES REGULATORPROTEINS SLYA.60
4.4.1. KONSTRUKTION EINER S/YA-INSERTIONSMUTANTE VON S. TYPHI TY514S.61
4.4.2. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE MIT PROTEINEXTRAKTEN DER
STAEMME
S. TYPHI TY514S UND S. TYPHI TY514S/JA.63
4.5. IN VRFRO-INFEKTIONSSTUDIEN MIT EIEC 12860 UND EIEC 1286QS/YA.64
4.5.1. INFEKTION VON J774A.1-MAKROPHAGEN MIT EIEC 12860 UND EIEC
1286QS/ A.65
4.5.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR AUFNAHME VON EIEC 12860 UND EIEC 1286QS/YA
DURCH
J774A.1-MAKROPHAGEN MIT HILFE VON GIEMSA-FAERBUNGEN. 67
4.5.3. ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSEN VON EIEC 12860 UND EIEC
1286QS7YA
NACH INFEKTION VON J774A.1-MAKROPHAGEN.68
4.5.4. MIKROINJEKTION FLUORESZENZ-MARKIERTER DERIVATE VON EIEC 12860 UND
EIEC
12860S/YA IN CACO-2 ZELLEN.70
4.5.5. INFEKTION VON J774A. 1-MAKROPHAGEN MIT GFP-EXPRIMIERENDEN
DERIVATEN VON
EIEC 12860 UND EIEC 1286QS/YA.71
4.5.6. UNTERSUCHUNGEN ZUR INDUKTION VON APOPTOSE IN J774A. 1
-MAKROPHAGEN DURCH
EIEC 12860 UND EIEC 1286QS/YA.73
4.5.7. INFEKTION VON HUMANEN DENDRITISCHEN VORLAEUFERZELLEN MIT EIEC
12860 UND
EIEC 12860S7YA. 75
4.5.8. UNTERSUCHUNGEN ZUR INDUKTION VON APOPTOSE IN HUMANEN
DENDRITISCHEN ZELLEN
DURCH EIEC 12860 UND EIEC 12860S/ A.76
5. DISKUSSION ^
5.1. PROTEOMANALYSEN ZUR UNTERSUCHUNG DER SLYA-REGULONS VON
ESCHERICHIA COLI UND
SALMONELLA TYPHIMURIUM.78
5.1.1. IDENTIFIZIERUNG DER IN E. COLI UND IN S. TYPHIMURIUM IN
ABHAENGIGKEIT VON SLYA
DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN PROTEINE.78
5.1.2. MOEGLICHE BETEILIGUNG SLYA-KONTROLLIERTER PROTEINE AN DER VIRULENZ
VON
COLI
UND S. TYPHIMURIUM.
5.1.3. BETEILIGUNG GLOBALER REGULATIONSFAKTOREN AN DER
EXPRESSIONSKONTROLLE DER IN
ANWESENHEIT VON SLYA DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN PROTEINE.84
5.1.4. DAS REGULATORPROTEIN SLYA ALS AKTIVATOR UND REPRESSOR DER
GENEXPRESSION IN
E.
COLI UND S. TYPHIMURIUM.
87
5.1.5. DER MOEGLICHE EINFLUSS DER SLYA-KONZENTRATION AUF DIE EXPRESSION
POTENTIELL
SLYA-REGULIERTER GENE.89
5.1.6. MOEGLICHE FUNKTIONEN DER AN DEN SLYA-REGULONS VON E COLI UND
S. TYPHIMURIUM BETEILIGTEN PROTEINE.
91
5.2.
LN VI/RO-INFEKTIONSSTUDIEN MIT ENTEROINVASIVEN ESCHERICHIA COLI.94
5.2.1. DAS INTRAZELLULAERE REPLIKATIONSVERHALTEN VON EIEC 12860.95
5.2.2. MOEGLICHE URSACHEN FUER EINEN VIRULENZVERLUST VON EIEC 12860.97
5.2.3. MOEGLICHE FUNKTIONEN VON SLYA IM INFEKTIONSZYKLUS VON EIEC
12860.100
6
. LITERATURVERAEICHILIS 103
7. ABKUERAUNGSVERAEICHNIS 124
8
. ANHANG 126 |
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