Untersuchungen zur Hitzeschockantwort und zur Immunogenität der Hitzeschockproteine GroEL, DnaK und ClpB von Campylobacter jejuni:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGEN
UND
ERLAEUTERUNGEN
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DAS
GUILLAIN-BARRE-SYNDROM
1
1.1.1
KLINIK
UND
IMMUNPATHOGENESE
1
1.1.2
ASSOZIATION
VON
C.
YE/UNI-INFEKTION
UND
GUILLAIN-BARR6-SYNDROM
2
1.2
CAMPYLOBACTER
JEJUNI
3
1.2.1
HISTORISCHER
KONTEXT
UND
TAXONOMIE
3
1.2.2
MIKROBIOLOGIE
VON
C.
JEJUNI
3
1.2.3
MOLEKULARBIOLOGIE
VON
C.
JEJUNI
4
1.2.4
PATHOLOGISCH-KLINISCHE
UND
EPIDEMIOLOGISCHE
ASPEKTE
DER
C.
YE/ZRA-INFEKTION
4
1.2.5
MOLEKULARE
PATHOGENESE
DER
C.
JEY'NM-INFEKTION
5
1.2.6
DIE
IMMUNANTWORT
AUF
EINE
C.
JE/UM-INFEKTION
5
1.3
HITZESCHOCKPROTEINE
6
1.3.1
ALLGEMEINES
UND
HISTORISCHER
KONTEXT
6
1.3.2
REGULATION
DER
BAKTERIELLEN
HITZESCHOCKANTWORT
7
1.3.3
HITZESCHOCKPROTEINE,
IMMUNANTWORT
UND
AUTOIMMUNITAET
8
1.4
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
11
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
13
2.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
13
2.2
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
13
2.2.1
STERILISIEREN
13
2.2.2
KULTURMEDIEN
13
2.2.3
E.
COLI
UND
C.
JEJUNI-STAEMME
14
2.2.4
E.
COLI
VEKTOREN
14
2.2.5
KULTURBEDINGUNGEN
14
2.2.6
KONSERVIERUNG
VON
BAKTERIENKULTUREN
15
2.2.6.1
KURZFRISTIGE
KONSERVIERUNG
15
2.2.6.2
LANGFRISTIGE
KONSERVIERUNG
(GLYCERIN-STAMMKULTUREN)
15
2.2.7
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
15
2.2.7.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
15
II
2.2.7.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
15
2.2.73
AUSPLATTIEREN
TRANSFORMIERTER
ZELLEN
16
23
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
16
23.1
GEBRAEUCHLICHE
LOESUNGEN
UND
PUFFER
16
23.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
17
23.3
GELELEKTROPHORESEN
17
23.4
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
17
23.4.1
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
C.JEJUNI
17
23.4.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
18
23.4.2.1
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
("MINI-PRAEPARATION
"
)
18
23.4.2.2
PRAEPARATIVE
PLASMIDPRAEPARATION
(
"
MAXI-PRAEPARATION
"
)
18
23.43
ISOLIERUNG
VON
ELEKTROPHORETISCH
AUFGETRENNTEN
DNA-FRAGM
ENTEN
19
23.4.4
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
C.JEJUNI
19
23.5
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
20
23.6
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
MEMBRANEN
20
23.6.1
"
SOUTHERN
BLOT
"
VON
DNA
AUF
NYLON-MEMBRANEN
20
23.6.2
"
NORTHERN
BLOT
"
VON
RNA
AUF
NYLON-MEMBRANEN
21
23.63
"
COLONY
BLOTTING
"
VON
DNA
AUS
BAKTERIENKOLONIEN
AUF
NYLON-MEMBRANEN
21
23.7
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
21
23.7.1
MARKIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
21
23.7.2
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
22
23.8
HYBRIDISIERUNGEN
22
23.9
HERSTELLUNG
UND
SCREENING
VON
GENOMISCHEN
C.
JEJUNI-GERTOAIKEN
23
23.10
ENZYMATISCHE
MANIPULATION
VON
NUKLEINSAEUREN
23
23.10.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
23
23.10.2
ABSPALTUNG
UEBERSTEHENDER
DNA-EINZELSTRAENGE
24
23.103
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
24
23.10.4
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-ENDEN
24
23.10.5
DNASE
I-VERDAU
VON
RNA-PRAEPARATIONEN
24
23.10.6.
ENZYMATISCHE
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
PCR
25
23.10.6.1
PCR
MIT
DEGENERIERTEN
PRIMERN
25
23.10.6.2
"
SEMI-NESTED
"
PCR
MIT
ZUFALLSPRIMEM
(UP-PCR)
25
23.10.63
PCR
MIT
VENT-POLYMERASE
26
23.11
DNA
SEQUENZANALYSE
26
23.11.1
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRANG-DNA
26
23.11.2
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPE
ISTRANG-DNA
28
23.12
BESTIMMUNG
DES
STARTPUNKTS
EINER
RNRNA
(PRIMEREXTENSIONSANALYSE)
28
IN
2.3.13
RAP-PCR
29
2.3.14
COMPUTER-AUSWERTUNG
UND
VERWENDETE
SOFTWARE
30
2.4
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
31
2.4.1
KLONIERUNG
DER
EXPRESSIONSKONSTRUKTE
31
2.4.2
ANALYTISCHE
PROTEINEXPRESSION
UND
LOKALISATION
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
31
2.4.3
NATIVE
REINIGUNG
DER
CYTOPLASMATISCHEN
PROTEINE
32
2.4.3.1
PRAEPARATIVE
PROTEINEXPRESSION
UND
ZELLAUFSCHLUSS
32
2.4.3.2
NI
2+
-CHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
32
2.4.3.3
GELFILTRATION
32
2.4.3.4
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
33
2.4.4
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
33
2.5
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
34
2.5.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
34
2.5.1.1
METHODE
NACH
MARKWELL
34
2.5.1.2
METHODE
NACH
BRADFORD
34
2.5.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
35
2.6
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
35
2.6.1
IMMUNOBLOT
(WESTERN-BLOT)
35
2.6.2
ELISA
36
3.
ERGEBNISSE
37
3.1
DER
GROSS
LOKUS
VON
C.
JEJUNI:
NUKLEOTIDSEQUENZ,
EXPRESSION,
IMMUNOGENITAET
39
3.1.1
KLONIERUNG
DES
GROSS
LOKUS
39
3.1.2
SEQUENZIERUNG
UND
EIGENSCHAFTEN
DES
GROSS
LOKUS
40
3.1.3
SEQUENZVERGLEICHE
ZWISCHEN
CPNLO
UND
CPN60
PROTEINEN
VON
C.
JEJUNI
UND
DENEN
ANDERER
SPEZIES
42
3.1.4
EIGENSCHAFTEN
DES
NICHTKODIERENDEN
BEREICHS
DES
GROSS
LOKUS
42
3.1.5
SYNTHESE
DES
GRAEZS-TRANSKRIPTS
UND
DES
CPN60
PROTEINS
IN
VIVO
42
3.1.6
REKOMBINANTE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
CPN60
PROTEINS
45
3.1.7
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ANTIGENITAET
DES
REKOMBINANTEN
CPNOEO
PROTEINS
46
3.2
DER
DNAK
LOKUS
VON
C.
JEJUNI:
NUKLEOTIDSEQUENZ,
EXPRESSION,
IMMUNOGENITAET
47
3.2.1
KLONIERUNG
DES
DNAK
GENS
47
3.2.2
SEQUENZIERUNG
UND
EIGENSCHAFTEN
DES
DNAK
LOKUS
48
IV
3.2.3
VERGLEICHE
DER
AMIN
OSAEURENSEQUENZ
DER
GRPE
UND
DNAK
PROTEINE
VON
C.
JEJUNI
MIT
DENEN
ANDERER
BAKTERIELLER
SPEZIES
52
3.2.4
SYNTHESE
DES
DNAK
TRANSKRIPTS
IN
VIVO
52
3.2.5
REKOMBINANTE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
DNAK
PROTEINS
53
3.2.6
IMMUNOGENITAET
DES
REKOMBINANTEN
D
NAK
PROTEINS
55
3.2.7
DIE
HUMORALE
ANTWORT
VON
GBS-PATIENTEN
GEGEN
ICJCPNOEO
UND
RCJDNAK
55
3.3
DER
CLPB LOKUS
VON
C.
JEJUNI:
NUKLEOTIDSEQUENZ,
EXPRESSION,
UND
IMMUNOGENITAET
56
3.3.1
SEQUENZIERUNG
DES
CLPB
LOKUS
VON
C.
JEJUNI
56
3.3.2
KLONIERUNG
DES
PROMOTORS
DES
CLPB-GENS
59
3.3.3
EIGENSCHAFTEN
DES
CLPB LOKUS
62
3.3.4
SEQUENZVERGLEICHE
ZWISCHEN
DEM
CLPB
PROTEIN
VON
C.
JEJUNI
UND
DEN
CLPB-HOMO
LOGEN
PROTEINEN
ANDERER
ORGANISMEN
62
3.3.5
EIGENSCHAFTEN
DES
NICHTKODIERENDEN
BEREICHS
DE
S
CLPB
GENS
63
3.3.6
SYNTHESE
DES
CZPB-TRANSKRIPTS
IN
VIVO
64
3.3.7
REKOMBINANTE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
CLPB
PROTEINS
64
3.3.8
IMMUNOGENITAET
DES
REKOMBINANTEN
CLPB
PROTEINS
66
3.4
UNTERSUCHUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
EXPRESSION
NACH
HITZESCHOCK
MITTELS
RAP-PCR
67
3.4.1
AMPLIFIKATION
VON
RAP-PCR-FRAGMENTEN
67
3.4.2
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
ION
GENS
67
3.4.3
EIGENSCHAFTEN
DES
ION
GENS
70
3.4.4
VERIFIZIERUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
EXPRESSION
DES
ION
GENS
71
4.
DISKUSSION
73
4.1
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
C.
JEJUNI
HITZESCHOCKGENEN
73
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
KLONIERTEN
HITZESCHOCKGENE
VON
C.
JEJUNI
75
4.3
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
IN
C.
JEJUNI
77
4.4
IMMUNOGENITAET
DER
HITZESCHOCKPROTEINE
VON
C.
JEJUNI
80
4.5
DIE
MOEGLICHE
BEDEUTUNG
DER
HITZESCHOCKPROTEINE
VON
C.
JEJUNI
IN
DER
PATHOGENESE
DES
GBS
82
5.
ZUSAMMENFASSUNG
84
6.
LITERATURVERZEICHNIS
86
V
LITERATURLISTE
DANKSAGUNGEN
LEBENSLAUF |
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