Genetische Organisation und Transkription eines Virulenz-assoziierten, instabilen Chromosomenabschnitts von Listeria ivanovii:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG.1
2 EINLEITUNG.5
2.1 ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE DER LISTERIEN.5
2.2 PATHOGENESE.6
2.3 INTRAZELLULAERER INFEKTIONSZYKLUS UND VIRULENZFAKTOREN VON
L. MONOCYTOGENES UND
L. IVANOVII
.8
2.3.1 EINDRINGEN IN DIE WIRTSZELLE.11
2.3.2 UEBERLEBEN IM UND ENTKOMMEN AUS DEM PHAGOSOM.16
2.3.3 VERMEHRUNG UND VERBREITUNG IM ZYTOPLASMA.20
2.3.4 ZELL-ZU-ZELL-AUSBREITUNG.22
2.4 GENETISCHE ORGANISATION UND EVOLUTION DER VIRULENZDETERMINANTEN.24
2.5 REGULATION DER VIRULENZGENEXPRESSION.28
3 MATERIAL.33
3.1 GERAETE.33
3.2 VERBRAUCHSMATERIAL.33
3.3 MEDIEN UND AGARPLATTEN.34
3.4 ANTIBIOTIKA.34
3.5 ZELLLINIEN.35
3.6 PLASMIDE.35
3.7 BAKTERIENSTAEMME.36
3.8 OLIGONUKLEOTIDE.37
3.9 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD.41
3.10 KITS.41
4 METHODEN.42
4.1 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN. 42
4.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI.42
4.1.2 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS LISTERIEN.42
4.1.3 RNASE-BEHANDLUNG VON DNA.44
4.1.4 REINIGUNG VON DNA.44
4.1.5 DNA-FAELLUNG.44
4.1.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.44
4.1.7 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA.45
4.1.8 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).46
4.1.9 REAMPLIFIKATION VON PCR-PRODUKTEN.47
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.1.10 REKOMBINANTE PCR (272).49
4.1.11 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA.50
4.1.12 KLENOW / PNK-BEHANDLUNG.51
4.1.13 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA.51
4.1.14 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN. 51
4.1.15 TRANSFORMATION IN
E. COLI.52
4.1.16 ELEKTROPORATION IN LISTERIEN (203).53
4.1.17 PROTOPLASTIERUNG VON LISTERIA (270). 53
4.1.18 MUTAGENESE DURCH HOMOLOGE REKOMBINATION VON
L. MONOCYTOGENES (23,270). 55
4.1.19 GENOME WALKING.55
4.1.20 DNA-SEQUENZIERUNG.59
4.1.21 HERSTELLUNG VON GLYCERINKULTUREN.60
4.1.22 ISOLIERUNG VON RNA AUS LISTERIEN.60
4.1.23 DNASE-BEHANDLUNG VON RNA. 61
4.1.24 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA. .61
4.1.25 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA IM FORMALDEHYDGEL.62
4.1.26 REVERSE TRANSKRIPTION (RT) UND PCR MIT CDNA.62
4.2 ZELLKULTUR.64
4.2.1 AUFTAUEN UND EINFRIEREN VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN (77).64
4.2.2 SUBKULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN.65
4.2.3 BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL (LZZ).65
4.2.4 INFEKTION VON SAEUGERZELLEN MIT LISTERIEN.65
4.2.5 INTRAZELLULAERE RNA-ISOLIERUNG (53). 67
4.3 UNTERSUCHUNG DES WACHSTUMSVERHALTENS VON
LISTERIA IVANOVII.67
4.3.1 WACHSTUM BEI 20C UND 37C.67
4.3.2 WACHSTUM MIT UND OHNE MEM ("MEM-SHIFT").67
4.3.3 MIC-TEST.67
5 ERGEBNISSE.68
5.1 SEQUENZIERUNG DES IMBEKANNTEN, IN DER MUTANTE GD-3 DELETIERTEN
BEREICHS
UPSTREAM (RECHTS) VON
SMCL.69
5.1.1 SUCHE NACH DEM RECHTEN ENDE DER DELETION MITTELS GENOME WALKING.69
5.1.2 SEQUENZIERUNG DES RECHTS VON
SMCL LIEGENDEN BEREICHS.71
5.1.3 SEQUENZANALYSE DES UPSTREAM VON
SMCL LIEGENDEN BEREICHS.75
5.1.4 VORKOMMEN DES ANALYSIERTEN BEREICHS IN ANDEREN
LISTERIA-ARTEN:
HOMOLOGIEVERGLEICH MIT
L. MONOCYTOGENES UND L. INNOCUA.78
5.1.5 BESTIMMUNG DES RECHTEN ENDES DER DELETION.86
5.2 EIGENSCHAFTEN DES DELETIERTEN BEREICHS DOWNSTREAM (LINKS) VON
SMCL.87
5.2.1 CHARAKTERISIERUNG DES LINKS VON
SMCL LIEGENDEN BEREICHS.87
5.2.2 EIGENSCHAFTEN DER NEU IDENTIFIZIERTEN INTEMALINE VON
L. IVANOVII.88
5.2.3 UNTERSUCHUNG DES "ZUSAMMENGESETZTEN" KLEINEN INTEMALINS I-INLG.91
5.2.4 BESTIMMUNG DES LINKEN ENDES DER DELETION.95
5.3 LISTERIA IVANOVII
PATHOGENITAETSINSEL 2 (LIPI-2).97
5.4 VORKOMMEN VON LIPI-2 IN VERSCHIEDENEN
L. ZVANOVUE-STAEMMEN UND ANDEREN
LISTERIA
ARTEN.99
5.4.1 VORHANDENSEIN UND STRUKTUR VON LIPI-2 IN VERSCHIEDENEN L.
IVANOVII-STAEMMEN. 99
5.4.2 VORKOMMEN VON LIPI-2 IN ANDEREN
LISTERIA-AITEN.:.100
5.4.3 ANALYSE DES BEREICHS
YSNB-YDEL IN L. SEELIGERI UND L. WELSHIMERI.110
5.5 VERGLEICH DER EXPRESSION VERSCHIEDENER GENE VON
L. IVANOVII MITTELS RT-PCR. 117
5.5.1 VORVERSUCHE. 118
5.5.2 NACHWEIS POLYCISTRONISCHER TRANSKRIPTE DER INTEMALINGENE.120
5.5.3 RT-PCR: VERGLEICH DER TRANSKRIPTION VERSCHIEDENER GENE VON
L. IVANOVII NACH
WACHSTUM BEI 20C UND 37C.YY.121
5.5.4 RT-PCR: VERGLEICH DER EXPRESSION DIVERSER GENE VON
L. IVANOVII NACH KULTUR IN
MINIMAL- UND VOLLMEDIUM.133
5.5.5 VERGLEICH DER TRANSKRIPTION VERSCHIEDENER GENE VON
L. IVANOVII NACH INFEKTION DER
ZELLLINIEN MDBK, J774 UND TIB-73.143
5.6 UNTERSUCHUNG DER DELETIONSHAEUFIGKEIT VON LIPI-1 UND LIPI-2.151
5.6.1 ENTWICKLUNG EINES POSITIVEN SELEKTIONSVERFAHRENS.151
5.6.2 HERSTELLUNG DER INSERTIONSPLASMIDE.152
6 DISKUSSION.156
6.1 CHARAKTERISIERUNG DER
L. IVANOVII MUTANTE GD-3.157
6.2 ANALYSE DER GENEXPRESSION IN
L. IVANOVII MITTELS RT-PCR.163
6.3 AUSBLICK.171
7 LITERATUR.172
8 ANHANG. 184
8.1 SEQUENZEN.184
8.1.1 SEQUENZ DES ANALYSIERTEN BEREICHS UPSTREAM (RECHTS) VON
SMCL.184
8.1.2 SEQUENZ VON
I-INLG IN VERSCHIEDENEN L. IVANOVII-STAEMMEN.200
8.1.3 PURH-SEQAENZ
VON L. IVANOVII.201
8.2 ABKUERZUNGEN.202 |
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