Einfluß von Bifidobacterium adolescentis auf die humorale Immunreaktion gegen Bacteroides thetaiotaomicron:
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| Sprache: | German |
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2000
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| Beschreibung: | Berlin, Freie Univ., Diss., 2001 |
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| adam_text | Titel: Einfluß von Bifidobacterium adolescentis auf die humorale Immunreaktion gegen Bacteroides thetaiota
Autor: Scharek, Lydia I.
Jahr: 2000
1. Einleitung.......................................................................................1
2.1 Das lokale Immunsystem des Darms (GALT) 2
2.2 Orale Toleranz ................................................................................4
2.3 Die intestinale Mikroflora..................................................................6
2.4 Toleranz gegen autochthone Mikroorganismen 9
2.5 Inhibitorische Zytokine.....................................................................10
2.6 Immunstimulation durch apathogene Darmbakterien................................12
2.7 Das Modell der MHC-Klasse I-b Moleküle 13
2.8 Ratten-Modell................................................................................15
2.9 Das Modell der gnotobiotischen Ratte..................................................16
3. Eigene Untersuchungen ....................................................................18
3.1 Zielsetzung....................................................................................18
3.2 Material........................................................................................19
3.2.1 Mikrobiologische Arbeitsschritte.........................................................19
3.2.1.1 Versuchsstämme .............................................................................19
3.2.1.2 Nährmedien und Puffer (Mikrobiologie) ...............................................19
3.2.1.3 Reagenzien, Verbrauchsmaterialien (Mikrobiologie) 22
3.2.1.4 Geräte (Mikrobiologie).....................................................................22
3.2.2 Herstellung des Bakterien-Rohextraktes 22
3.2.2.1 Bakteriensuspensionen (Rohextraktherstellung) 22
3.2.2.3 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (Rohextraktherstellung) 22
3.2.2.4 Geräte (Rohextraktherstellung)..........................................................23
3.2.3 Aufbereitung der Vollblut-Probe (Geräte)..............................................23
3.2.4 Antikörper-Extraktion aus Faeces und Darminhalten................................23
3.2.4.1 Puffer und Reagenzien (Antikörper-Extraktion) 23
3.2.4.2 Geräte (Antikörper-Extraktion)...........................................................24
3.2.5 Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)......................................24
3.2.5.1 Puffer (ELISA)...............................................................................24
3.2.5.2 Beschichtung der Mikrotiterplatten (MTP) 25
3.2.5.3 Probenmaterial ...............................................................................26
3.2.5.4 Nachweisantikörper........................................................................26
3.2.5.5 Antikörper-Standards.....................................................................27
3.2.5.6 Färbereagenzien..............................................................................27
3.2.5.7 Weitere Reagenzien und Verbrauchsmaterialien 28
3.2.5.8 Geräte .......................................................................................28
3.2.6 Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese 28
3.2.6.1 Polyacrylamidgele...........................................................................28
3.2.6.2 Probenmaterial ...............................................................................29
3.2.6.3 Puffer (SDS-PAGE).........................................................................29
3.2.6.4 Weitere Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (SDS-PAGE).....................30
3.2.6.5 Geräte (SDS-Page) ..........................................................................30
3.2.7 Semidry Blotting.............................................................................30
3.2.7.1 Puffer (Semidry Blotting)..................................................................30
3.2.7.2 Verbrauchsmaterialien (Semidry Blotting) :............................................31
3.2.8 Immundetektion..............................................................................31
3.2.8.1 Puffer (Immundetektion)...................................................................31
3.2.8.2 Antikörper (Immundetektion).............................................................32
3.2.8.3 weitere Reagenzien und Materialien (Immundetektion).............................32
3.2.8.4 Geräte (Immundetektion) ..................................................................33
3.2.9 Fluoreszenzassoziierter Immunoassay (FIA)..........................................33
3.2.9.1 Puffer (HA)...................................................................................33
3.2.9.2 Beschichtung (FIA) .........................................................................33
3.2.9.3 Zellmedium...................................................................................33
3.2.9.4 weitere Lösungen............................................................................35
3.2.9.5 Nachweisantikörper.........................................................................35
3.2.9.6 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (FIA)
3.2.9.7 Geräte (FIA)
3.2.10 Durchflußzytometrie........................................................................35
3.2.10.1 Antikörper.....................................................................................35
3.2.10.2 Puffer (HA)...................................................................................37
3.2.10.3 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.................................................37
3.2.10.4 Geräte (HA)..................................................................................38
3.2.11 Tierversuch....................................................................................38
3.2.11.1 Tiere............................................................................................38
3.2.11.2 Haltung und Futter ..........................................................................38
3.2.11.3 Narkose und Blutentnahme................................................................38
3.2.11.4 Desinfektionsmittel............................................................. 38
3.3 Methoden.....................................................................................41
3.3.1 Anzucht der Bakterien 41
3.3.2 Lebendzellzahl-Bestimmung in Faeces und Darminhalten 41
3.3.3 Gewinnung der Rohextrakte 42
3.3.4 Aufbereitung der Blut- und Faecesproben für ELISA-Messungen 43
3.3.4.1 Serumgewinnung ...........................................................................43
3.3.4.2 Trocknung der Faecesproben und Extraktion der Antikörper 43
3.3.5 Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) 44
3.3.5.1 Statistische Berechnung....................................................................46
3.3.6 Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS - PAGE) 46
3.3.7 Semidry Blotting.............................................................................46
3.3.8 Immundetektion..............................................................................47
3.3.9 Fluoreszenzassoziierter Immunoassay (FIA) ..........................................47
3.3.10 Durchflußzytometrie........................................................................50
3.3.10.1 Restimulation der Zellen...................................................................50
3.3.10.2 Fixierung der Zellen ........................................................................50
3.3.10.3 Intrazelluläre Färbung von IL-4 und IL-10 50
3.2.10.4 Färbung der Oberflächenantigene 51
3.3.11 Tierversuchs-Anordnung...................................................................52
3.3.12 Tiertötung .....................................................................................54
3.3.13 Überprüfung des Zuchtbestandes auf Keimfreiheit...................................56
3.4 Experimente und Ergebnisse..............................................................57
3.4.1. Zellzahlen in Rattenfaeces von monoassoziierten Tieren ...........................57
3.4.1.1 Besiedlungsverlauf bei Assoziation mit B. adolescentis ............................57
3.4.1.2 Besiedlungsverlauf bei Assoziation mit B. thetaiotaomicron 57
3.4.1.3 Besiedlung der einzelnen Darmabschnitte am 28. Versuchstag 59
3.4.2 Einfluß von Bifidobacterium adolescentis..............................................60
3.4.3 Messungen von Serum- und Faeces- Antikörpern mittels ELISA .......62
3.4.3.1 Grenzwert-Bestimmung....................................................................63
3.4.3.2 Immunogenität von Bifidobacterium adolescentis und
Bacteroides thetaiotaomicron.............................................................64
3.4.3.3 Einfluß von Bifidobacterium adolescentis auf die humorale Immunreaktion
gegen Bacteroides thetaiotaomicron.....................................................68
3.4.3.4 Einfluß von Bifidobacterium adolescentis auf die lokale Immunreaktion gegen
Bacteroides thetaiotaomicron .............................................................70
3.4.3.5 Verteilung der Antikörper in den verschiedenen Darmabschnitten 71
3.4.3.6 Kreuzreaktivität.............................................................................72
3.4.4 Immunoblotting................ ..........................................................76
3.4.5 Produktion von Antikörpern durch kultivierte Rattenzellen
(Fluoreszenzassoziierter Immunassay) 77
3.4.6 Fluoreszenzzytometrie.....................................................................79
4. Diskussion..................................................................................82
4.1 Einfluß von Bifidobacterium adolescentis auf die Zellzahlentwicklung von
Bactewides thetaiotaomicron ............................................................82
4.2 Unterschiedliche Immunogenität von B. adolescentis und B. thetaiotaomicron
und mögliche Ursachen ....................................................................83
4.3 Mögliche Ursachen für die Abschwächung der spezifischen Immunreaktion
gegen B. thetaiotaomicron.................................................................89
4.4 Schlußfolgerungen ..........................................................................93
4.5 Ausblick.......................................................................................94
5. Zusammenfassung...........................................................................96
6. Summary ......................................................................................98
7. Literatur......................................................................................100
Anhang.......................................................................................107
Danksagung .................................................................................113
Lebenslauf
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