Untersuchung kombinatorischer 434Cro-Bibliotheken zur Selektion von Proteinvarianten mit neuen DNA-Bindungseigenschaften:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
PROTEIN
DESIGN
.
1
1.2
1.2.1
1.2.2
1
2.3
1.2.4
DNA-BINDUNGSPROTEINE
ALS
REGULATOREN
DER
GENTRANSKRIPTION
.
2
TRANSKRIPTIONSKONTROLLE
BEIM
BAKTERIOPHAGEN
K
.
2
HELIX-TURN-HELIX-PROTEINE
.
4
434CRO
.
7
VERAENDERUNG
DER
BINDUNGSSPEZIFITAET
VON
DNA-BINDUNGSPROTEINEN
.
9
1.3
1.3
1
1.3.2
DAS
/AC-OPERON
.
11
AUFBAU
UND
FUNKTION
.
11
VERWENDUNG
DES
/AC-SYSTEMS
IN
DER
MOLEKULARBIOLOGIE
.
13
1.4
DAS
GENE
DES
PHAGEN
| X174
.
14
2
AUFGABENSTELLUNG
16
3
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
18
3.1
3.1.1
3.1.2
WEITERENTWICKLUNG
DES
GENE-SELEKTIONSPLASMIDS
.
18
EINBAU
EINER
SYNTHETISCHEN
PROMOTOR/OPERATOR-SEQUENZ
.
18
TOXIZITAETSUNTERSUCHUNGEN
MIT
DEM
PLASMID
PACK13
.
21
3.2
3.2.1
KONSTRUKTION
VON
/ACZ'-SELEKTIONSPLASMIDEN
.
23
VERVOLLSTAENDIGUNG
DES
/ACZ'-GENS
UND
AUSTAUSCH
DES
RESISTENZGENS
.
23
3.2.2
3.2
3
3.2.4
3
2.5
AUSTAUSCH
DER
PROMOTOR/OPERATOR-SEQUENZ
.
26
UNTERSUCHUNG
DER
REPRIMIERBARKEIT
DER
/ACZ'-TRANSKRIPTION
.
28
KLONIERUNG
EINES
/ACZ'-PLASMIDS
FUER
DEN
OPERATOREN-AUSTAUSCH
.
30
KLONIERUNG
DES
434O
R
3
UND
434OR1-SELEKTIONSPLASMIDS
.
32
3.3
KONSTRUKTION
EINES
434CRO-EXPRESSIONSPLASMIDS
.
33
3.4
REPRESSIONS-ANALYSEN
MIT
KCRO
UND
434CRO.
.
37
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
OPTIMIERUNG
DES
SELEKTIONSSYSTEMS
.
39
VERBESSERUNG
DES
434CRA-PLASMIDS
.
39
KONSTRUKTION
EINES
KONTROLLPLASMIDS
MIT
DELETION
IN
434CRO
.
43
KLONIERUNG
EINES
REPRESSORPLASMIDS
ZUM
AUSTAUSCH
DER
ERKENNUNGSHELIX
.
42
3.5.4
3.5.4.1
3.5.4.2
OPTIMIERUNG
DER
MEDIEN
UND
REPRESSIONSANALYSEN
.
44
INDIKATORMEDIUM
FUER
IN
VIVO
REPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN
.
44
VERBESSERUNG
DES
FLUESSIGMEDIUMS
FUER
IN
VITRO
ANALYSEN
.
46
36
VARIATION
DES
PROMOTOR-OPERATOR-ABSTANDES
.
49
3.7
3.7.1
3
7.2
KONSTRUKTION
VON
/ACZ-SELEKTIONSPLASMIDEN
.
54
EINBAU
DES
ZACZ-GENS
IN
DAS
SELEKTIONSPLASMID
.
54
ABSCHWAECHUNG
DER
PROMOTORSTAERKE
IM
/ACZ-PLASMID
PZ434OR3
.
55
3.8
ERZEUGUNG
UND
UNTERSUCHUNG
VON
434CRO-REPRESSOR-VARIANTEN
MIT
NEUEN
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
.
58
3.8.1
3.8.2
3.8.2.1
3.82.2
3.8.3
3.8.3.1
3.8.32
3.8.4
3.8.5
434CRO-BIBLIOTHEKEN
.
59
HERSTELLUNG
DER
CRO-BIBLIOTHEKEN
.
60
KONSTRUKTION
.
60
ELEKTROTRANSFORMATION
UND
ISOLIERUNG
DER
PLASMIDBIBLIOTHEK
.
63
SELEKTION
.
65
ZIELSEQUENZEN
.
65
SCREENING
.
66
SEQUENZIERUNG
UND
PHAENOTYPEN
.
68
ANALYSE
DER
BINDUNGSSPEZIFITAET
MIT
IN
VIVO
SS-GALACTOSIDASE
REPRESSIONS-UNTERSUCHUNGEN
.
71
3.8.5.1
ANALYSE
DER
GEGEN
DIE
434-OPERATOREN
SELEKTIERTEN
434CRO-MUTANTEN
72
3.85.2
ANALYSE
DER
GEGEN
DEN
XONS-OPERATOR
SELEKTIERTEN
434CRO-MUTANTEN
73
3.8.6
ANALYSE
DER
BINDUNGSSPEZIFITAET
MIT
IN
VITRO
SS-GALACTOSIDASE
REPRESSIONS-UNTERSUCHUNGEN
.
75
3.9
PROTEINPRAEPARATIONEN
.
79
3.10
3.10.1
3.10.2
3.10.3
MOBILITY-SHIFT-ASSAYS
.
80
ABSCHAETZEN
DER
RCT-REPRESSORKONZENTRATION
IM
PROTEIN-ROHEXTRAKT
.
81
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONTANTEN
DES
RCT/AE.OR3-KOMPLEXES.
82
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNGSSPEZIFITAET
DES
434CRO-VARIANTEN
RCT
.
84
3.11
ZUSAMMENFASSENDE
DISKUSSION
DER
434CRO-MUTANTEN
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
.
87
3.11.1
3.11.2
3.11.3
3.11.4
SELEKTIVITAET
DES
SYSTEMS
.
87
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG
DER
MUTANTEN
.
89
MUTANTEN
MIT
GROSSEN
ABWEICHUNGEN
VON
DER
434CRO-SEQUENZ
.
92
SPEZIFITAET
.
93
4
ZUSAMMENFASSUNG
96
5
MATERIAL
UND
METHODEN
100
5.1
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.1.4
5.1.5
5.1.6
5.1.7
MATERIAL
.
100
E.
COLI
STAEMME
UND
PLASMIDE
.
100
ENZYME
.
101
OLIGONUKLEOTIDE
.
102
MEDIEN
UND
ANTIBIOTIKA
.
105
CHEMIKALIEN
.
105
WEITERE
MATERIALIEN
.105
GERAETE
.
106
5.2
5.2.1
5
2.2
5.2.3
KULTIVIERUNG
UND
STAMMHALTUNG
.
107
MEDIEN,
AGARPLATTEN
UND
ANTIBIOTIKA
.107
AUFBEWAHRUNG
DER
E.
COLI
KULTUREN
.
109
WACHSTUMSMESSUNGEN
UND
ZELLZAHLBESTIMMUNG
.
109
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.3.5
5.3.6
5.3.7
ALLGEMEINE
METHODEN
.
110
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZEILEN
.
110
KOMPETENTE
E.
COLI
ZELLEN
FUER
DIE
ELEKTROTRANSFORMATION
.
111
TRANSFORMATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
ZELLEN
.
111
PLASMID-MINIPRAEPARATION
ALKALISCHE-LYSE-METHODE
.
112
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
.
113
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
LOW-MELTING-AGAROSE
.
115
POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
ZUR
TRENNUNG
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
116
5.3.8
5.3.9
5.3.10
5.3.11
5.3.12
5.3.13
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
117
DNA-RESTRIKTION
.
117
LIGATION
.
118
DNA-FAELLUNG
.118
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
118
BESTIMMUNG
DER
SS-GALACTOSIDASE-AKTIVITAET
.
119
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5
4.4
5.4.5
5.4.6
5
4.7
5.4.8
5.4.9
5.4.10
5.4.11
5.4.12
5.4.13
5.4.14
KLONIERUNG
DER
PLASMIDE
.
121
ANNEALING
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
122
PLASMID
PACK13
.
122
PLASMID
PPOR3DELLACZ
'
.
123
PLASMID
PPOR3LACZ
'
.123
PLASMID
PPOR3KAN1
.124
PLASMID
PPRO2OR3
.
125
PLASMID
PP2LAMBDLACZ
'
.126
PLASMID
PP2434OR3
.
127
PLASMID
PP2434OR1
.
128
PLASMID
PFB1
.
128
PLASMIDE
PFB3
UND
PFB18
.
129
PLASMID
PZ434OR3
.130
PLASMIDE
PZP(1-10)434OR3
.
131
PLASMID
P434CRO
.
132
5.4.14.1
KLONIERUNG
132
5.4.14.2
SEQUENZIERUNG
DES
PLASMIDS
P434CRO
.133
5.4.15
54.16
5.4.17
5.4.18
5.4.19
PLASMID
P434CRODELA
.135
PLASMID
P434CRO2
.135
PLASMID
P434CRODELB
.136
PLASMIDE
P434CRO3
UND
P434CRODELC
.
136
PLASMID
P434CRO-UNC2
.
137
5.5
5.5.1
5.5.1.1
5.5.1.2
5.5.1.3
5.5.2
5.5.2.1
5.52.2
HERSTELLUNG
DER
REPRESSOR-BIBLIOTHEKEN
.
138
NNS-BIBLIOTHEK
.
138
KLONIERUNG
.
138
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
.139
LIBRARY-PLASMID-PRAEPARATION
.140
TRI-BIBHOTHEKEN
.
141
TRI-BIBLIOTHEK
1
.
141
TRI-BIBLIOTHEK
2
144
5.6
SCREENING
DER
BIBLIOTHEKEN
145
5.6.1
1.
SCREENING
145
5.6.2
ISOLIERUNG
DER
REPRESSOR-PLASMIDE
UND
KONTROLL-SCREENING
146
5.7
SEQUENZIERUNG
146
5.7.1
PLASMIDPRAEPARATION
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
147
5.7.2
SEQUENZIER-PRIMER
148
5.7.3
SEQUENZIER-REAKTION
148
5.7.4
HERSTELLUNG
UND
GIESSEN
DES
GELS
.
149
5.7.5
BELADEN
DES
SEQUENZIERGELS
UND
ELEKTROPHORESE
.149
5.8
BIOCHEMISCHE
METHODEN
150
5.8.1
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD,
1976
150
5.8.2
TRICIN-SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
151
5.8.3
ISOLIERUNG
DER
REPRESSOR-PROTEINE
153
5.8.3.1
KULTIVIERUNG
153
5.8.3.2
AUFSCHLUSS
DER
ZELLEN
UND
LONENTAUSCHCHROMATOGRPHIE
153
5.8
3.3
GELFILTRATION
155
5.9
MOBILITY-SHIFT-ASSAY
157
5.9.1
HERSTELLUNG
VON
ZELLPROTEIN-ROHEXTRAKTEN
157
5.9.2
LABELN
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
32
P
.
159
5.9.3
ASSAY
160
5.9.4
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
K
D
162
6
LITERATURVERZEICHNIS
163
7
ANHANG
167
A
ABKUERZUNGEN
167
B
PLASMIDKARTEN
169
C
MESSDATEN
DER
SS-GALACTOSIDASE-ASSAYS
182
D
DNA-SEQUENZEN
DER
434CRO-MUTANTEN
191 |
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