Charakterisierung von hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanälen (HCN-Kanäle) in der Retina und im Gehirn der Ratte:
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
2001
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| Schriftenreihe: | Berichte des Forschungszentrums Jülich
3936 |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
I
II
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VI
1
EINLEITUNG
1
1.1
HYPERPOLARISATIONSAKTIVIERTE
UND
ZYKLISCH
NUKLEOTID-GESTEUERTE
LONENKANAELE
1
1.2
STRUKTURELLE
EIGENSCHAFTEN
VON
HCN-KANAELEN
3
1.3
DIE
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
VON
HCN-KANAELEN
5
1.4
AUFBAU
DER
RETINA
9
1.5
ZIELSETZUNG
12
2
MATERIAL
UND
METHODEN
13
2.1
MATERIAL
13
2.2
E.COZZ-ZELLKULTUR
14
2.2.1
VERWENDETER
BAKTERIENSTAMM
UND
PLASMIDVEKTOREN
14
2.2.2
ZUSAMMENSETZUNG
UND
HERSTELLUNG
DER
KULTURMEDIEN
FUER
E.COLI
15
2.2.3
ANZUCHT
VON
E.COZZ-BAKTERIENKULTUREN
15
2.2.3.1
ANZUCHT
VON
E.COZZ-ZELLEN
ZUR
PLASMIDPRAEPARATION
15
2.2.3.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
ZUR
TRANSFORMATION
MIT
PLASMID-DNA
15
2.2.3.3
ANZUCHT
VON
E.COZZ'-ZELLEN
ZUR
EXPRESSION
VON
MALTOSE-BINDEPROTEIN
(MBP)
UND
MBP-FUSIONSPROTEINEN
16
2.3
PLASMID-DNA-PRAEPARATIONEN
16
2.3.1
MINI-PRAEPARATION
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
NACH
BIMBOIM
&
DOLY
(1979)
16
2.3.2
ALKALISCHE
MAXI
UND
MEGA-PRAEPARATIONEN
17
2.4
REINIGUNG
UND
TRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
18
2.4.1
PHENOL/CHLOROFORMEXTRAKTION
18
2.4.2
ETHANOL-PRAEZIPITATION
18
2.4.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
19
2.4.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
MIT
HILFE
VON
AGAROSE-GELEN
19
2.4.3.2
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
19
2.4.4
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
AGAROSE-GELEN
19
2.4.5
DNA-GROESSEN
UND
MENGENSTANDARD
20
2.4.6
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
20
II
I
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.6.1
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
DURCH
ADSORPTION
AN
QIAEX
(QIAGEN)
20
2.4.6.2
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
NACH
DER
ZENTRIFUGATIONSMETHODE
21
2.5
MANIPULATION
VON
NUKLEINSAEUREN
21
2.5.1
RESTRIKTION
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
21
2.5.2
MODIFIZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
22
2.5.2.1
GLAETTEN
UEBERHAENGENDER
EINZELSTRANG-ENDEN
22
2.5.2.2
PHOSPHORYLIERUNG
DER
5
'-ENDEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
22
2.5.23
DEPHOSPHORYLIERUNG
GESCHNITTENER
DNA-VEKTOREN
22
2.5.3
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
23
2.5.3.1
LIGATION
23
2.53.2
TRANSFORMATION
23
2.6
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEUREN
24
2.6.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
SPEZIFISCHER
SONDEN
24
2.6.2
UNTERSUCHUNG
DER
GENEXPRESSION
IN
MENSCHLICHEN
GEWEBEN
24
2.6.3
HYBRIDISIERUNG
VON
IMMOBILISIERTER
POLY(A)
+
-RNA
MIT
DNA-SONDEN
UND
AUTORADIOGRAPHIE
25
2.7
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
26
2.7.1
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
26
2.7.2
BEDINGUNGEN
FUER
DIE
PCR-REAKTIONEN
27
2.7.3
REINIGUNG
DER
PCR-PRODUKTE
27
2.8
DNA-SEQUENZIERUNG
MIT
LI-COR
DNA-SEQUENZIERER
28
2.8.1
SEQUENZIERREAKTION
28
2.8.2
PCR
ZUR
SEQUENZIERUNG
28
2.8.3
ACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
SEQUENZIERUNG
29
2.9
HETEROLOGE
GENEXPRESSION
IN
HEK
293-ZELLEN
29
2.9.1
KULTURBEDINGUNGEN
FUER
HEK
293-ZELLEN
30
2.9.2
TRANSIENTE
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IN
HEK
293-ZELLEN
31
2.10
PRAEPARATION
VON
MEMBRANPROTEINEN
32
2.10.1
PRAEPARATION
VON
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
MEMBRANPROTEINEN
AUS
HEK
293-ZELLEN
32
2.10.2
PRAEPARATION
VON
MEMBRANPROTEINEN
AUS
NATIVEN
GEWEBEN
33
2.11
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
33
2.11.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
(1976)
33
III
I
INHALTSVERZEICHNIS
2.11.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
MIT
AMIDOSCHWARZ
34
2.12
MODIFIKATION
VON
MEMBRANPROTEINEN
34
2.12.1
SOLUBILISIERUNG
VON
MEMBRANPROTEINEN
34
2.12.2
DEGLYKOSYLIERUNG
VON
MEMBRANPROTEINEN
35
2.13
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
GELELEKTROPHORESE
35
2.13.1
V
ERWENDETE
PROTEIN-GROESSENSTANDARDS
36
2.13.2
FAERBEN
VON
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
MIT
DER
COOMASSIE-BLAUFAERBUNG
36
2.14
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
PROTEINE
37
2.14.1
TRANSFER
UND
IMMOBILISIERUNG
VON
PROTEINEN
("WESTEMBLOT")
37
2.14.2
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
IMMOBILISIERTEN
PROTEINEN
37
2.15
IMMUNZYTOCHEMIE
38
2.15.1
FIXIERUNG
UND
IMMUNZYTOCHEMISCHE
FAERBUNGEN
VON
HEK
293-ZELLEN
38
2.15.2
LICHTMIKROSKOPISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
IN
DER
RATTENRETINA
39
2.15.3
LICHTMIKROSKOPISCHER
NACHWEIS
VON
HCN-KANAELEN
IM
RATTENGEHIM
41
2.15.4
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER
NACHWEIS
VON
HCN3
IN
DER
RATTENRETINA
42
2.16
HERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
44
2.16.1
KOPPLUNG
VON
PEPTIDEN
AN
TRAEGERPROTEINE
44
2.16.1.1
KOPPLUNG
VON
PEPTIDEN
AN
TRAEGERPROTEINE
UEBER
3-MALEIMIDOBENZOYL
N-HYDROXY-SUCCINIMIDESTER
(MBS)
44
2.16.1.2
KOPPLUNG
VON
PEPTIDEN
AN
TRAEGERPROTEINE
UEBER
GLUTARALDEHYD
(GA)
45
2.16.2
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
MALTOSE-BINDEPROTEIN
(MBP)
UND
VON
MBP-FUSIONSPROTEINEN
46
2.16.2.1
EXPRESSION
VON
MBP
UND
VON
MBP-FUSIONSPROTEINEN
46
2.16.2.2
REINIGUNG
VON
MBP
UND
VON
MBP-FUSIONSPROTEINEN
46
2.16.3
IMMUNISIERUNG
VON
RATTEN
UND
HERSTELLUNG
VON
HYBRIDOMZELLEN
47
2.17
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
47
2.17.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
48
2.17.2
REINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
48
2.18
IMMUNPRAEZIPITATION
49
2.18.1
IMMOBILISIERUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
AN
PROTEIN
G
SEPHAROSE
49
2.18.2
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
SOLUBILISIERTEN
MEMBRANPROTEINEN
AN
EINER
ANTIKOERPER/SAEULENMATRIX
50
IV
I
INHALTSVERZEICHNIS
3
ERGEBNISSE
52
3.1
EXPRESSION
DER
HCN-KANAELE
IN
MENSCHLICHEN
GEWEBEN
53
3.1.1
GEWEBESPEZIFISCHE
EXPRESSION
VON
HHCNL
53
3.1.2
GEWEBESPEZIFISCHE
EXPRESSION
VON
HHCN4
55
3.2
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
HCN
KANAELE
57
3.2.1
ANTIGENE
ZUR
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
HCN-KANAELE
57
3.2.2
HERSTELLUNG,
TEST
UND
REINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
60
3.2.3
HERSTELLUNG
UND
TEST
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
61
3.2.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
POLY
UND
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
AN
TRANSFIZIERTEN
HEK
293-ZELLEN
63
3.2.4.1
WESTEMBLOT-ANALYSEN
AN
TRANSFIZIERTEN
HEK
293-ZELLEN
64
3.2.4.2
IMMUNZYTOCHEMISCHE
ANALYSEN
AN
TRANSFIZIERTEN
HEK
293-ZELLEN
67
3.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
HCN-KANAELE
IN
DER
RATTENRETINA
69
3.3.1
WESTEMBLOT-ANALYSEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
DER
RATTENRETINA
69
3.3.2
LOKALISATION
DER
HCN-KANAELE
IN
DER
RATTENRETINA
73
3.3.2.1
LOKALISATION
DER
HCN-KANAELE
IN
DER
AEUSSEREN
RATTENRETINA
75
3.3.2.2
LOKALISATION
DER
HCN-KANAELE
IN
DER
INNEREN
RATTENRETINA
77
3.3.3
IMMUNPRAEZIPITATIONEN
86
3.3.3.1
OPTIMIERUNG
DER
IMMUNPRAEZIPITATION
87
3.3.3.2
IMMUNPRAEZIPITATIONEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
AUS
TRANSFIZIERTEN
HEK
293-ZELLEN
91
3.3.3.3
IMMUNPRAEZIPITATIONEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
DER
RATTENRETINA
94
3.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
HCN-KANAELE
IM
RATTEN
UND
MAUSGEHIM
96
3.4.1
WESTEMBLOT-ANALYSEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
DES
RATTEN
UND
MAUSGEHIMS
97
3.4.2
LOKALISATION
DER
HCN-KANAELE
IM
RATTENGEHIM
99
4
DISKUSSION
105
4.1
GEWEBESPEZIFISCHE
EXPRESSION
DER
HCN-KANAELE
105
4.2
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
HCN-KANALPROTEINE
108
4.3
LOKALISATION
DER
HCN-KANAELE
IN
DER
RATTENRETINA
111
4.4
BILDEN
HCN-KANAELE
HOMO
ODER
HETEROOLIGOMERE
KANALKOMPLEXE?
116
4.5
AUSBLICK
120
V
I
INHALTSVERZEICHNIS
5
ZUSAMMENFASSUNG
122
6
ABSTRACT
123
7
LITERATURVERZEICHNIS
124
8
ANHANG
132
8.1
AMINOSAEURESEQUENZVERGLEICH
DER
HCN-KANAELE
HCN1
BIS
HCN4
AUS
DER
RATTE
132
8.2
ZUSAMMENFASSUNG
DER
WESTEMBLOT-ANALYSEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
DER
RATTENRETINA
134
8.3
ZUSAMMENFASSUNG
DER
WESTEMBLOT-ANALYSEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
DES
RATTENGEHIRNS
135
8.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
WESTEMBLOT-ANALYSEN
MIT
MEMBRANPROTEINEN
DES
MAUSGEHIMS
136
8.5
ZUR
TRANSFEKTION
VERWENDETE
CDNA-KLONE
VON
HCN-KANAELEN
137
8.6
VERWENDETE
PRIMAERE
ANTIKOERPER
(HCN-UNSPEZIFISCH)
138
8.7
VERWENDETE
SEKUNDAERE
UND
TERTIAERE
ANTIKOERPER
139
8.8
SEQUENZEN
UND
HYBRIDISIERUNGSBEREICHE
ALLER
VERWENDETER
PRIMER
140 |
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