Neue Hemmstoffe der humanen TNF-a-Expression aus Pilzen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Kaiserslautern, Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | 181 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
TNF-A
ALS
TARGET
ZUR
BEHANDLUNG
INFLAMMATORISCHER
ERKRANKUNGEN
.
1
1.2
STRUKTUR
UND
BIOLOGIE
VON
TNF-A
.
1
1.3
REGULATION
DER
TNF-A
EXPRESSION
.
4
1.4
MOEGLICHKEITEN
ZUR
ANTI-TNF-A
THERAPIE
.
7
1.5
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
12
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1
CHEMIKALIEN
.
13
2.2
MEDIEN,
PUFFERUND
LOESUNGEN
.
16
2.2.1
NAEHRMEDIEN
FUER
PILZE
UND
BAKTERIEN
.
16
2.2.2
MEDIEN
FUER
ZELLKULTUREN
.
18
2.2.3
PUFFER-UND
SALZLOESUNGEN
.
19
2.2.4
ENZYME
.
24
2.3
OLIGONUCLEOTIDE
.
24
2.3.1
SEQUENZIERUNGSPRIMER
.
24
2.3.2
POLYMERASE-KETTENREAKTIONS(PCR)-PRIMER
.
25
2.3.3
OLIGONUCLEOTIDE
FUER GELSHIFT-ASSAYS
.
25
2.4
PLASMIDE
.
26
2.5
ORGANISMEN
.
28
2.5.1
BEARBEITETE
PILZSTAEMME
.
28
2.5.2
TESTORGANISMEN
FUER
DIE
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.
29
2.5.3
BAKTERIEN
FUER
DIE
TRANSFORMATION
.
29
2.5.4
ZELLLINIEN
.
30
2.6
VERMEHRUNG
UND
LAGERUNG
VON
ZELLLINIEN
UND
BAKTERIENKULTUREN
.
31
2.6.1
KULTIVIERUNG
EUKARYONTISCHER
ZELLKULTUREN
.
31
2.6.2
AUFBEWAHRUNG
DER
BAKTERIENKULTUREN
.
31
2.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
32
2.7.1
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
32
2.7.1.1
PLASMID
MINI-PRAEPARATION
.
32
2.7.1.2
PLASMID
MAXI-PRAEPARATION
.
32
2.7.1.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
HELA-S3-ZELLEN
.
33
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.1.4
RNA-ISOLIERUNG
AUS
U937
ZELLEN
.
33
2.7.1.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
2.7.2
RESTRIKTION
UND
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
2.7.2.1
RESTRIKTION
VON
DNA
.
33
2.7.2.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
34
2.7.2.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
34
2.7.2.4
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
34
2.7.2.5
RNA
GELELEKTROPHORESE
.
34
2.7.3
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
35
2.7.3.1
PCR
MIT
GENOMISCHER
DNA
.
35
2.7.3.2
QUANTITATIVE
RT-PCR
.
36
2.7.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO//-ZELLEN
(TOP
1
0F')
UND
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
37
2.7.5
LIGATION
UND
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
37
2.7.6
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
38
2.8
KULTIVIERUNG
DER
PILZE
IN
SUBMERSKULTUR
.
38
2.8.1
FERMENTATION
IN
SCHUETTELKULTUR
.
38
2.8.2
FERMENTATION
DER
PRODUZENTENSTAEMME
IM
20
I-MASSSTAB
.
39
2.8.3
FERMENTATIONSANALYSEN
.
40
2.8.3.1
PH-WERT
.
40
2.8.3.2
ENZYMATISCHE
BESTIMMUNG
DES
GLUCOSE
UND
MALTOSEGEHALTES
.
40
2.8.3.3
MYCELTROCKENGEWICHT
.
40
2.8.3.4
ABGASANALYTIK
.
40
2.8.3.5
WIRKSTOFFBESTIMMUNG
MIT
HILFE
DER
ANALYTISCHEN
HPLC
.
41
2.9
CHROMATOGRAPHISCHE
TECHNIKEN
ZUR
REINIGUNG
UND
ANALYSE
DER
WIRKSTOFFE
.
41
2.9.1
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
41
2.9.2
HPLC-ANALYSE
.
42
2.9.3
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
43
2.9.4
UVA/IS
UND
IR-SPEKTROSKOPIE
.
44
2.10
METHODEN
ZUR
BIOLOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
.
44
2.10.1
TRANSFEKTIONSMETHODEN
.
44
2.10.1.1
ELEKTROPORATION
VON
JURKAT-,
U937-,
RAW
264.7
UND
HEPG2-ZELLEN
44
2.10.1.2
ELEKTROPORATION
VON
HELA-S3
ZELLEN
.
45
2.10.2
REPORTERGEN-ASSAYS
.
45
INHALTSVERZEICHNIS
2.10.2.1
TNF-A
PROMOTER
KONTROLLIERTE
REPORTERGENEXPRESSION
.
45
2.10.2.2
COX-2
PROMOTOR
KONTROLLIERTE
REPORTERGENEXPRESSION
.
46
2.10.2.3
AP-1-ABHAENGIGE
SIGNALTRANSDUKTION
.
46
2.10.2.4
NF-AT-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
.
46
2.10.2.5
NF-XB-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
.
47
2.10.2.6
STAT3-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
.
47
2.10.2.7
STAT1
BZW.
STAT2-ABHAENGIGE
SIGNALTRANSDUKTION
.
47
2.10.2.8
COTRANSFEKTION
MIT
PFC-MEKI
.
47
2.10.2.9
YYDUAL-LUCIFERASE
REPORTER-ASSAY
"
SYSTEM
.
48
2.10.2.10
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
AUF
DIE
SEAP-ENZYMAKTIVITAET
.
48
2.10.3
CYTOTOXIZITAETSTEST
.
49
2.10.3.1
GIEMSA-FAERBUNG
MIT
MONOLAYERKULTUREN
.
49
2.10.3.2
BESTIMMUNG
DER
LEBENDZELLZAHL
MIT
MTS
.
49
2.10.4
REAKTION
MIT
MODELLTHIOLEN
.
49
2.10.5
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO50
2.10.6
WESTERN
IMMUNOBLOTTING
.
50
2.10.6.1
UNTERSUCHUNG
DER
PHOSPHORYLIERUNG
DER
ERK1/2-,
MEK1/2-,
JNK/SAPK
UND
P38
MAP-KINASEN
.
50
2.10.6.2
UNTERSUCHUNG
DER
PHOSPHORYLIERUNG
VON
STAT1
UND
STAT3
.
51
2.10.6.3
NACHWEIS
DER
CYCLOOXYGENASE-2
(COX-2)
UND
DER
INDUZIERBAREN
NO
SYNTHASE
(NOS-2)
.
52
2.10.6.4
UNTERSUCHUNG
DER
IXB-DEGRADATION
UND
PHOSPHORYLIERUNG
.
53
2.10.7
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
DER
ISOLIERTEN
VERBINDUNGEN
AUF
DIE
DNA
BINDUNG
VERSCHIEDENER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
MIT
GELSHIFT-ASSAYS
.
53
2.10.7.1
MARKIERUNG
DER
OLIGONUCLEOTIDE
.
53
2.10.7.2
HERSTELLUNG
DER
ZELLEXTRAKTE
FUER
DIE
GELSHIFT-ASSAYS
.
54
2.10.7.3
GELSHIFT-ASSAY
.
54
2.10.8
UNTERSUCHUNG
ZUM
EINFLUSS
DER
WIRKSTOFFE
AUF
DIE
TNF-A
EXPRESSION
IN
JURKAT
UND
U937-ZELLEN
.
55
2.10.9
AGARDIFFUSIONSTEST
MIT
PILZEN
UND
BAKTERIEN
.
55
3
ERGEBNISSE
.
56
3.1
ETABLIERUNG
EINES
ASSAYSYSTEMS
ZUR
SUCHE
NACH
INHIBITOREN
DER
HUMANEN
TNF-A
EXPRESSION
.
56
3.1.1
ENTWICKLUNG
DER
TNF-A
PROMOTOR
REPORTERGENVEKTOREN
.
56
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.2
ENTWICKLUNG
DER
CYCLOOXYGENASE-2
(COX-2)
PROMOTOR
REPORTERGENVEKTOREN
.
58
3.1.3
UEBERPRUEFUNG
DER
PROMOTOREN
IN
DEN
REPORTERGENVEKTOREN
.
60
3.1.4
OPTIMIERUNG
DER
INDUKTIONSBEDINGUNGEN
.
62
3.1.5
EVALUIERUNG
DES
TESTSYSTEMS
.
63
3.1.6
UEBERTRAGUNG
DES
TESTSYSTEMS
AUF
ANDERE
ZELLLINIEN
.
65
3.2
SCREENING
NACH
INHIBITOREN
DER
HUMANEN
TNF-A
EXPRESSION
.
66
3.3
ISOLIERUNG
VON
INHIBITOREN
DER
TNF-A
EXPRESSION
.
67
3.3.1
GLIOVIRIN
AUS
TRICHODERMA
HARZIANUM
HA
130-97
.
67
3.3.1.1
DER
PRODUKTIONSSTAMM
TRICHODERMA
HARZIANUM
HA
130-97
.
67
3.3.1.2
FERMENTATION
VON
TRICHODERMA
HARZIANUM
HA
130-97
.
68
3.3.1.3
ISOLIERUNG
VON
GLIOVIRIN
AUS
HA
130-97
.
69
3.3.1.4
PHYSIKALISCH-CHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
GLIOVIRIN
.
69
3.3.2
D99007-1
AUS
CHAETOMIUM
SUBSPIRALE
D99007
.
72
3.3.2.1
DER
PRODUKTIONSSTAMM
CHAETOMIUM
SUBSPIRALE
D99007
.
72
3.3.2.2
FERMENTATION
VON
CHAETOMIUM
SUBSPIRALE
D99007
.
72
3.3.2.3
ISOLIERUNG
VON
D99007-1
AUS
CHAETOMIUM
SUBSPIRALE
.
73
3.3.2.4
PHYSIKALISCH-CHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
D99007-1
.
74
3.3.3
A1
1-99-1
AUS
MOLLISIA
MELALEUCA
.
77
3.3.3.1
DER
PRODUKTIONSSTAMM
MOLLISIA
MELALEUCA
HA
A1
1
-99
.
77
3.3.3.2
FERMENTATION
VON
MOLLISIA
MELALEUCA
HA
A11-99
.
77
3.3.3.3
ISOLIERUNG
VON
A1
1
-99-1
AUS
MOLLISIA
MELALEUCA
HA
A1
1
-99
.
78
3.3.3.4
PHYSIKALISCH-CHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
A1
1-99-1
.
80
3.4
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
VERBINDUNGEN
.
81
3.4.1
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
GLIOVIRIN
.
81
3.4.1
1
.WIRKUNG
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
TNF-A
PROMOTOR
VERMITTELTE
LUCIFERASE
EXPRESSION
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLLINIEN
.
81
3.4.1.2
.
WIRKUNG
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
TNF-A
EXPRESSION
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLLINIEN
.
82
3.4.1.3
.
UNTERSUCHUNG
DER
WIRKUNG
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
TNF-A
MRNA
KONZENTRATION
.
83
3.4.1.4
.
REPORTERGENASSAYS
ZUR
MESSUNG
DES
EINFLUSSES
VON
GLIOVIRIN
AUF
VERSCHIEDENE
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADEN
.
85
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1.5
.WIRKUNG
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
CYCLOOXYGENASE-2
UND
DER
INDUZIERBAREN
NO-SYNTHASE
IN
RAW
264.7
ZELLEN
.
87
3.4.1.6
CYTOTOXIZITAETSTEST
MIT
GLIOVIRIN
.
88
3.4.1.7
REAKTION
MIT
L-CYSTEIN
UND
DTT
.
88
3.4.1.8
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.
89
3.4.1.9
WIRKUNG
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
DURCH
COTRANSFEKTION
MIT
PFC-MEK1
STIMULIERTE
AP-1
ABHAENGIGE
REPORTERGENEXPRESSION
.
90
3.4.1.10
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
DER
ERK-.MEK-,
P38
UND
JNK/SAPK-MAP
KINASEN
.
91
3.4.1.11
EINFLUSS
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
VON
AP-1
IN
HELA-S3
ZELLEN
.
94
3.4.1.12
WIRKUNG
VON
GLIOVIRIN
AUF
DIE
I
K
B
DEGRADATION
IN
JURKAT
ZELLEN
.
95
3.4.1.13
UNTERSUCHUNG
DER
STAT1
UND
DER
STAT3
PHOSPHORYLIERUNG
.
96
3.4.1.14
ANTIMIKROBIELLES
WIRKUNGSSPEKTRUM
.
97
3.4.2
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
D99007-1
.
98
3.4.2.1
.
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIE
TNF-A
PROMOTOR
VERMITTELTE
LUCIFERASE
EXPRESSION
IN
JURKAT
ZELLEN
.
98
3.4.2.2
.
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIE
TNF-A
EXPRESSION
IN
U937
PROMONOCYTEN
.
99
3.4.2.3
.
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
D99007-1
AUF
DIE
SEAP
ENZYMAKTIVITAET
.
100
3.4.2.4
REPORTERGENASSAYS
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
DER
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIVERSE
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADEN
.
100
3.4.2.5
.
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
CYCLOOXYGENASE-2
UND
DER
INDUZIERBAREN
NO-SYNTHASE
IN
RAW
264.7
MACROPHAGEN
101
3.4.2.6
REAKTION
MIT
L-CYSTEIN
UND
DTT
.
102
3.4.2.7
CYTOTOXIZITAETSTEST
MIT
D99007-1
.
102
3.4.2.8
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.
103
3.4.2.9
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
DER
MEK1/2-,
ERK1/2
UND
P38-MAP-KINASEN
.
103
3.4.2.10
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIE
L-XB-DEGRADATION
UND
DIE
I
K
B
OL
PHOSPHORYLIERUNG
IN
JURKAT
T-ZELLEN
.
105
3.4.2.11
WIRKUNG
VON
D99007-1
AUF
DIE
STAT3
PHOSPHORYLIERUNG
.
107
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.2.12
ANTIMIKROBIELLES
WIRKUNGSSPEKTRUM
VON
D99007-1
.108
3.4.3
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
A1
1-99-1
.109
3.4.3.1
.
WIRKUNG
VON
A1
1-99-1
AUF
DIE
TNF-A
PROMOTOR
VERMITTELTE
LUCIFERASEEXPRESSION
IN
JURKAT
ZELLEN
.109
3.4.3.2
.WIRKUNG
VON
A1
1-99-1
AUF
DIE
TNF-A
EXPRESSION
IN
U937
UND
JURKAT
ZELLEN
.110
3.4.3.3
WIRKUNG
VON
A1
1-99-1
AUF
VERSCHIEDENE
SIGNALTRANSDUKTIONS
KASKADEN
.
111
3.4.3.4
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
A1
1-99-1
AUF
DIE
SEAP
ENZYMAKTIVITAET
.
112
3.4.3.5
CYTOTOXIZITAETSTEST
MIT
A1
1-99-1
.
112
3.4.3.6
REAKTION
MIT
DTT
.
112
3.4.3.7
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.113
3.4.3.8
WIRKUNG
VON
A1
1-99-1
AUF
DIE
I-KB-DEGRADATION
IN
JURKAT
T-ZELLEN1
14
3.4.3.9
ANTIMIKROBIELLES
WIRKUNGSSPEKTRUM
VON
A1
1-99-1
.
115
3.4.4
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
JE981006,
JE990121,
JE990407
UND
JE010301
.
116
3.4.4.1
DIE
VERBINDUNGEN
.
116
3.4.4.2
WIRKUNG
DER
VERBINDUNGEN
AUF
DIE
TNF-A
PROMOTOR
VERMITTELTE
LUCIFERASE
EXPRESSION
.
117
3.4.4.3
EINFLUSS
DER
PODOSCYPHIC
ACID
DERIVATE
AUF
DIE
TNF-A
EXPRESSION
IN
HUMANEN
PROMONOCYTEN
.
118
3.4.4.4
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
JE990407
AUF
VERSCHIEDENE
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE
.
119
3.4.4.5
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
DER
VERBINDUNGEN
AUF
DIE
SEAP
ENZYMAKTIVITAET
.
121
3.4.4.6
WIRKUNG
DER
PODOSCYPHIC
ACID
DERIVATE
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
CYCLOOXYGENASE-2
UND
DER
INDUZIERBAREN
NO-SYNTHASE
IN
MURINEN
MACROPHAGEN
.
121
3.4.4.7
CYTOTOXIZITAETSTEST
MIT
JE981006,
JE990407,
JE990121
UND
JE010301
.
123
3.4.4.8
REAKTION
MIT
L-CYSTEIN
UND
DTT
.
123
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.4.9
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.
124
3.4.4.10
EINFLUSS
VON
JE990407
AUF
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
DER
P38
UND
ERK1/2
MAP
KINASEN
.
124
3.4.4.11
ANTIMIKROBIELLES
WIRKUNGSSPEKTRUM
VON
JE990407,
JE990121
UND
JE981006
.
126
4
DISKUSSION
.
127
4.1
ENTWICKLUNG
UND
ETABLIERUNG
EINES
TESTSYSTEMS
ZUR
SUCHE
NACH
HEMMSTOFFEN
DER
HUMANEN
TNF-A
EXPRESSION
.
128
4.1.2
DIE
REPORTERGENVEKTOREN
.
128
4.1.3
WAHL
DER
ZELLLINIEN
.
130
4.1.4
EVALUIERUNG
DES
SCREENINGSYSTEMS
.132
4.2
SCREENING
.
133
4
3
INHIBITOREN
DER
HUMANEN
TNF-A
EXPRESSION
AUS
HOEHEREN
PILZEN
.
135
4.3.1
GLIOVIRIN
AUS
TRICHODERMA
HARZIANUM
HA
130-97
.
135
4.3
2
D99007-1
AUS
CHAETOMIUM
SUBSPIRALE
D99007
.
137
4.3.3
A1
1-99-1
AUS
MOLLISIA
MELALEUCA
A11-99
.
138
4.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
WIRKUNGSMECHANISMUS
DER
INHIBITOREN
DER
HUMANEN
TNF-A
EXPRESSION
.
139
4.4.1
GLIOVIRIN
.
139
4.4.2
D99007-1
.
149
4.4.3
A1
1-99-1
.
152
4.4.4
JE981006,
JE990407,
JE990121
UND
JE010301
.
154
4.5
ANTIINFLAMMATORISCHE
NATURSTOFFE
UND
DEREN
WIRKUNGSWEISE
.
156
4.6
TABELLARISCHE
ZUSAMMENFASSUNG
DER
WIRKUNGEN
DER
VERBINDUNGEN
IN
DEN
EINZELNEN
TESTSYSTEMEN
.
160
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
165
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
167 |
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