Entwicklung fluorimetrischer Methoden zur Bestimmung der Affinität und Aktivität von Liganden G-Protein-gekoppelter Rezeptoren an intakten Zellen:
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Regensburg
2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 KONVENTIONELLE METHODEN ZUR PHARMAKOLOGISCHEN TESTUNG MIT HILFE VON
ZELL
KULTUREN.3
1.1.1 LIGAND-REZEPTOR-BINDUNGSSTUDIEN.3
1.1.2 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN AN INTAKTEN ZELLEN.5
1.2 NEUROPEPTID Y UND NPY-REZEPTORSUBTYPEN.6
1.2.1 NEUROPEPTID Y.6
1.2.2 NEUROPEPTID Y-REZEPTOREN.6
1.2.2.1 NPY YI-REZEPTOR.'.7
1.2.2.2 NPY Y
2-REZEPTOR. 8
1.2.2.3 NPY Y
3-REZEPTOR.9
1.2.2.4 NPY Y
4-REZEPTOR.9
1.2.2.5 NPY YJ-REZEPTOR.9
1.2.2.6 NPY Y6-REZEPTOR.10
1.2.3 MOEGLICHE THERAPEUTISCHE INDIKATIONEN FUER NPY-REZEPTORLIGANDEN.10
1.3 HISTAMIN UND HISTAMINREZEPTORSUBTYPEN.11
1.4 FLUORIMETRISCHE METHODEN ZUR BESTIMMUNG VON LIGAND-REZEPTOR-WECHSEL
WIRKUNGEN .12
1.4.1 THEORIE.12
1.4.2 MESSUNG DER ZELLASSOZIIERTEN FLUORESZENZ.14
1.4.2.1 SPEZIELLE PROBLEME BEI KUEVETTENMESSUNGEN.14
1.4.2.2 DURCHFLUSSZYTOMETRIE.16
1.4.3 EINZELMOLEKUELDETEKTION UND FLUORESZENZKORRELATIONSSPEKTROSKOPIE.17
1.4.4 FLUORESZENZPOLARISATION.19
1.4.5 ZEITAUFGELOESTE MESSUNGEN UND ENERGIETRANSFER.22
1.4.6 BESTIMMUNG VON INTRAZELLULAEREM CA
2+ MITTELS FLUORESZENZ ODER LUMINESZENZ.23
2 PROBLEMSTELLUNG.25
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION.27
VI
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.1 SYNTHESE, TRENNUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER NPY-DERIVATE UND
VERWENDETEN
FLUOROPHORE.28
3.1.1 AUSWAHL DER FLUOROPHORE.28
3.1.2 SYNTHESE DER NPY-DERIVATE.32
3.1.3 TRENNUNG UND PHARMAKOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER FLUORESZENTEN
NPY-
DERIVATE .33
3.1.4 BESTIMMUNG DER QUANTENAUSBEUTE I DES
CARBOXYFLUORESCEIN-MARKIERTEN NPY. 39
3.1.5 AENDERUNG DER FLUORESZENZINTENSITAET VON CYANIN-5-DERIVATEN BEI DER
BINDUNG AN
SERUMALBUMIN.41
3.1.6 AUTOFLUORESZENZ VON ZELLEN ALS LIMITIERENDER FAKTOR FUER DIE
SENSITIVITAET
FLUORIMETRISCHER TESTS.42
3.2 FLUORESZENZMESSUNGEN AM KONVENTIONELLEN SPEKTROFLUORIMETER.45
3.2.1 SPEKTRALER SHIFT UND INTENSITAETSMESSUNGEN.45
3.2.1.1 NPY-REZEPTORLIGANDEN.45
3.2.1.2 VERSUCHE ZUR INDIREKTEN DETEKTION VON SPEZIFISCH GEBUNDENEM
CARBOXYFLUORESCEIN-NPY.51
3.2.1.3 FLUORESZENTE ARGININAMID-DERIVATE ALS NPY YI-ANTAGONISTEN.52
3.2.1.4 FLUORESZENTE CHINAZOLIN-DERIVATE ALS NPY YJ-ANTAGONISTEN.53
3.2.1.5 FLUORESZENTE HISTAMIN HPANTAGONISTEN.55
3.2.2 FLUORESZENZPOLARISATION/-ANISOTROPIE.58
3.2.3 CA
2+-ASSAY IN DER KUEVETTE.60
3 .3 FLUORIMETRISCHE BESTIMMUNGEN IN DER MIKROTITERPLATTE.63
3.3.1 CA
2+-ASSAY IM 96-WELL-FORMAT.63
3.3.2 EINZELMOLEKUELDETEKTION DES CY5-NPY.66
3.4 UNTERSUCHUNG DER REZEPTORBINDUNG AUF SUBZELLULAERER EBENE MIT HILFE
DER KONFOKALEN
FLUORESZENZMIKROSKOPIE./.68
3.5 DURCHFLUSSZYTOMETRIE.76
3.5.1 UNTERSUCHUNGEN AN HEL-ZELLEN.78
3.5.1.1 KOMPETITIVE BINDUNG DES FLUORESZENTEN LIGANDEN CY5-NPY.78
3.5.1.2 AUSWERTUNG DER MESSDATEN IN DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE.80
3.5.1.3 FAERBUNG DER HEL-ZELLEN MIT PROPIDIUMIODID.81
3.5.1.4 VERGLEICH DER UNTERSCHIEDLICHEN MESSBEDINGUNGEN UND DER
FLUORESZENTEN
NPY-DERIVATE.88
VII
3.5.1.5 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE VON [
3H]-PROPIONYL-NPY UND DER
YI-REZEPTORENDICHTE VON HEL-ZELLEN.83
3.5.1.6 ASSOZIATIONSKINETIK UND SAETTIGUNGSEXPERIMENTE.84
3.5.1.7 BESTIMMUNG VON BINDUNGSDATEN UNTER GLEICHGEWICHTSBEDINGUNGEN.
86
3.5.2 BESTIMMUNG VON BINDUNGSDATEN AN Y
2-REZEPTOR-TRANSFIZIERTEN SMS-KAN-
ZELLEN.01
3.5.3 KOMPETITIVE BINDUNG AN Y5-REZEPTOR-TRANSFIZIERTEN HEC-1
B-ZELLEN.94
3.5.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR NPY-REZEPTOREXPRESSION WEITERER ZELLLINIEN.96
3.5.5 VERGLEICH FLUORESZENTER CYANIN-DERIVATE VON NPY.97
3.5.6 VALIDIERUNG DER FLUORIMETRISCHEN TESTSYSTEME MIT DER
RADIOLIGANDBINDUNG.99
3.5.7 KORRELATION DER TESTERGEBNISSE.
102
4 ZUSAMMENFASSUNG.
103
5 EXPERIMENTELLER TEIL.
107
5.1 ALLGEMEINES.'07
5.1.1 TESTSUBSTANZEN. 'O
7
5.1.2 GERAETE.'O
7
5.1.3 STRUKTURANALYTIK.' 08
5.1.4 VERBRAUCHSMATERIAL UND CHEMIKALIEN.'08
5.2 ZELLKULTUR.'00
,5.2.1 REAGENZIEN.'09
5.2.2 ZELLLINIEN.''0
5.2.3 KULTURBEDINGUNGEN.''-
5.3 SYNTHESE VON FLUORESZIERENDEN NPY-DERIVATEN.'
5.3.1 SYNTHESEVORSCHRIFTEN.' '-
5.3.2 HPLC-REINIGUNG DER DERIVATISIERTEN PEPTIDE.' '4
5.3.3 GEHALTSBESTIMMUNG DER PEPTIDE.115
5.3.4 SPEKTREN DER NPY-DERIVATE.' '6
5.3.5 BESTIMMUNG DER QUANTENAUSBEUTE.' -0
5.3.6 MESSUNG DER FLUORESZENZPOLARISATION.' -'
5.3.7 QUENCHING MIT ANTIFLUORESCEIN-ANTIKOERPER.'2'
5.3.8 CA
2+-ASSAY IN DER MIKROTITERPLATTE.'21
5.3.9 EINZELMOLEKUELDETEKTION.'22
VIII
5.3.10 KONFOKALE MIKROSKOPIE.123
5.4 RADIOLIGAND-BINDUNGSASSAYS AN NPY
YYI- UND YJ-REZEPTOREN.124
5.4.1 REAGENZIEN.124
5.4.2 MEMBRANPRAEPARATION VON SMS-KAN- UND HEL-ZELLMEMBRANEN FUER RADIO-
LIGANDBINDUNG UND VERSUCHE ZUR POLARISATION.126
5.4.3 YI-REZEPTOR-BINDUNGSASSAY MIT INTAKTEN SK-N-MC-ZELLEN.127
5.4.4 Y|- REZEPTOR-BINDUNGSASSAY MIT INTAKTEN HEL-ZELLEN.127
5.4.5 Y?- REZEPTOR-BINDUNGSASSAY AN SMS-KAN-ZELLMEMBRANEN.128
5.4.6 Y5- REZEPTOR-BINDUNGSASSAY AN HEC-1B-Y5-ZEL!EN.129
5.5 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN CA
2+-KONZENTRATION AN HEL-ZELLEN.129
5.5.1 REAGENZIEN.129
5.5.2 GERAETEEINSTELLUNG.131
5.5.3 VORBEREITUNG DER ZELLEN.131
5.5.4 KALIBRIERUNG UND BERECHNUNG DES [CA2+]I-ANSTIEGS.132
5.6 BESTIMMUNG DER REZEPTORBINDUNGSKONSTANTEN MIT DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE.133
5.6.1 MESSANORDNUNG.^.'33
5.6.2 VORBEREITUNG DER ZELLEN.133
5.6.3 GERAETEEINSTELLUNG AM FACS-CALIBUR
YY
.134
5.7 BERECHNUNG DER PHARMAKOLOGISCHEN KENNGROESSEN.135
5.7.1 ABKUERZUNGEN UND DEFINITIONEN.135
5.7.2 BERECHNUNG VON K
D-WERTEN AUS SAETTIGUNGSEXPERIMENTEN (RADIOLIGANDBINDUNG) 135
5.7.3 BERECHNUNG VON ICSO-WERTEN AUS KOMPETITIONSKURVEN IM RADIOUEGAND-
BINDUNGSASSAY.'36
5.7.4 BERECHNUNG VON ECSO-WERTEN AUS KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN.136
5.7.5 BERECHNUNG VON ICSO-WERTEN FUER DIE ANTAGONISTISCHE WIRKUNG IM CA'
-ASSAY UND
IN DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE.136
6 LITERATURVERZEICHNIS.139
IX |
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| spelling | Mayer, Matthias Verfasser aut Entwicklung fluorimetrischer Methoden zur Bestimmung der Affinität und Aktivität von Liganden G-Protein-gekoppelter Rezeptoren an intakten Zellen vorgelegt von Matthias Mayer Regensburg 2002 IX Bl., 147 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Universität Regensburg 2002 Biologische Aktivität (DE-588)4291566-1 gnd rswk-swf Chemische Affinität (DE-588)4132311-7 gnd rswk-swf GTP-bindende Proteine (DE-588)4248354-2 gnd rswk-swf Fluorimetrie (DE-588)4154843-7 gnd rswk-swf Ligand Biochemie (DE-588)4606532-5 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content GTP-bindende Proteine (DE-588)4248354-2 s Ligand Biochemie (DE-588)4606532-5 s Biologische Aktivität (DE-588)4291566-1 s Fluorimetrie (DE-588)4154843-7 s DE-604 Chemische Affinität (DE-588)4132311-7 s Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-opus-717 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-opus-717 Resolving-System kostenfrei Volltext https://epub.uni-regensburg.de/9916/ Verlag kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009808568&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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