Molekulare Analyse der mRNA-Expression von Plasma-Prokallikrein: Expressionsprofil in humanen Geweben und Mechanismen der Transkriptionsregulation
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| Format: | Buch |
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2001
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I
NHALTSVERZEICHNIS
I
I
NHALTSVERZEICHNIS
A
Z
USAMMENFASSUNG
.
1
B
E
INLEITUNG
.
3
B.
1
PLASMA
KALLIKREIN
(FLETCHER-FAKTOR)
.
3
B.1.1
GEN
UND
MOLEKUELSTRUKTUR
.
3
B.1.2
VORKOMMEN
.
3
B.1.3
SYNTHESEORT
.
3
B.
1.4
AKTIVIERUNG
.
4
B.2
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTIONEN
.
4
B.2.1
KONTAKTAKTIVIERUNG
.
5
B.2.2
FIBRINOLYSE-SYSTEM
.
5
B.2.3
DAS
KALLIKREIN-KININ
SYSTEM
.
7
B.3
PATHOPHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DES
PLASMA
KALLIKREINS
.
10
B.4
AUFGABENSTELLUNG
.
10
C
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
.
12
C.L
MATERIALIEN
.
12
C.1.1
GERAETE
.
12
C.
1.2
SUBSTANZEN
UND
MATERIALIEN
.
13
C.1.3
ESCHERICHIA
COLI
STAEMME
.
16
C.L.
4
ZELLLINIEN
.
16
C.L.4.1
HEPG2
.
16
C.L.
4.2
HEK293
.
16
C.L.
5
PLASMID-VEKTOREN
.
17
C.L.
5.1
PUC18
(2690
BP)
.
17
C.
1.5.2
PCRII-TOPO
(3950
BP)
.
17
C.
1.5.3
PSEAP2-BASIC
(4677
BP)
.
18
C.L.
5.4
PSEAP2-CONTROL
(5115
BP)
.
20
C.
1.6
SOFTWARE
ZUR
GENOMANALYSE
.
20
C.2
METHODEN
.
21
C.2.
1
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
.
21
C.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
22
C.2.3
REINIGUNG,
KONZENTRIERUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
22
C.2.4
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
.
23
C.2.5
DNA-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
23
C.2.6
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
26
C.2.7
DNA-SEQUENZANALYSE
.
26
C.2.8
SPALTUNG
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
26
C.2.
9
LIGIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
T4-DNA-LIGASE
.
26
C.2.
10
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
26
C.2.
11
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
.
27
I
NHALTSVERZEICHNIS
N
C.2.
12
RNA
LIGASE-MEDIATED
RAPID
AMPLIFICATION
OF
5'-CDNA
ENDS
(RLM-RACE)
.
27
C.2.
12.1
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
27
C.2.12.2
PRINZIP
UND
DURCHFUEHRUNG
.
28
C.
2.12.3
PCR-ANSATZ
.
30
C.2.13
GENOME
WALKER
VERFAHREN
.
31
C.2.
13.1
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
31
C.2.13.2
BESCHREIBUNG
UND
DURCHFUEHRUNG
.
31
C.2.
14
HERSTELLUNG
VON
REPORTERGENPLASMIDEN
.
32
C.2.
15
TRANSFEKTION
VON
HEPG2
UND
HEK
293-ZELLEN
.
33
C.2.
15.1
DURCHFUEHRUNG
DER
TRANSFEKTION
MIT
REPORTERGENPLASMIDEN
.
33
C.2.1
6
DETEKTION
UND
QUANTIFIZIERUNG
DES
REPORTERPROTEINS
SEAP
.
34
C.2.16.1
SEAP-BESTIMMUNG
.
34
C.2.
17
ERZEUGUNG
VON
PPK-PROMOTORVERKUERZUNGSVARIANTEN
.
35
C.2.
18
AMPLIFIKATION
DES
INTRON
1
BEREICHS
.
36
C.2.18.1
OLIGONUKLEOTIDE
.
36
C.2.1
8.2
DURCHFUEHRUNG
.
36
C.2.
19
QUANTITATIVE
PCR
MITTELS DER
TAQMAN-TECHNOLOGIE
.
37
C.2.1
9.1
PRINZIP
.
37
C.2.
19.2
CDNA
AUS
HUMANEN
GEWEBEN
.
38
C.2.
19.3
HERSTELLUNG
EINES
CDNA-STANDARDS
AUS
LEBER-MRNA
.
39
C.2.19.4
PCR-EFFIZIENZ
UND
TAQMAN-STANDARDKURVE
.
39
C.2.
19.5
RELATIVE
QUANTIFIZIERUNG
UND
RELATIVE
STANDARDKURVE
.
41
C.2.
19.6
TAQMAN
PRIMER
UND
SONDEN
.
42
C.2.
19.7
TAQMAN
PCR-BEDINGUNGEN
.
43
C.2.20
BESTIMMUNG
DER
STABILITAET
VON
PPK
UND
GAPDH-MRNA
.
44
C.2.20.
1
ZELLKULTUREXPERIMENTE
.
45
C.2.20.2
RNA-ISOLIERUNG
AUS
HEPG2-ZELLEN
.
45
C.2.20.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
46
C.2.20.4
BESTIMMUNG
VON
MRNA-HALBWERTSZEITEN
MITTELS
QUANTITATIVER
RT-PCR
.
46
C.2.21
ZELLSTIMULATION
VON
HEPG2-ZELLEN
MIT
PHOFBOL-12-MYRISTAT-13-ACETAT
(PMA)
UND
LIPOPOLYSACCHARIDEN
(LPS)
.
46
C.2.2
1.1
DURCHFUEHRUNG
DER
ZELLSTIMULATIONSVERSUCHE
.
47
D
E
RGEBNISSE
.
48
D.
1
QUANTITATIVE
RT-PCR
(TAQMAN-ANALYSE)
.
48
D.
1.1
VALIDIERUNG
DER
METHODE
.
48
D.
1.2
EFFIZIENZEN
DER
TAQMAN-PCRS
.
50
D.
1.3
RELATIVE
QUANTIFIZIERUNG
DER
TRANSKRIPTE
VON
PPK,
HK,
LK,
FXI
UND
FXII
IN
HUMANEN
GEWEBEN
.
50
D.2
ZELLSTIMULATION
VON
HEPG2-ZELLEN
MIT
PMA
UND
LPS
.
54
D.2.
1
ERGEBNISSE
DER
LPS-STIMULATION
.
54
D.2.2
ERGEBNISSE
DER
PMA-STIMULATION
.
56
D.3
STABILITAET
DER
RNAS
VON
PPK
UND
GAPDH
.
58
D.4
BESTIMMUNG
DES
PPK-TRANSKRIPTIONSSTARTS
MITTELS
DER
RLM-RACE
METHODE
.
59
D.4.
1
PPK-TRANSKRIPTIONSSTARTKARTIERUNG
IN
MRNAS
AUS
LEBER,
PANKREAS,
NIERE
UND
TESTIS
.
59
D.4.2
ANALYSE
DER
CONSENSUS-SEQUENZEN
FUER
DIE
TRANSKRIPTIONSINITIATION
.
61
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
D.5
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
PPK-PROMOTORREGION
.
63
D.5.1
KLONIERUNG
DER
PROMOTORREGION
MITTELS
DER
GENOME
WALKER
METHODE
.
63
D.5.2
AKTIVITAETSANALYSE
DER
PPK-PROMOTORREGION
.
65
D.6
KONSTRUKTION
VON
PROMOTORVERKUERZUNGSVARIANTEN
.
66
D.6.1
ANALYSE
DES
P-1729
BP
PROMOTORREGION
NACH
BINDUNGSSTELLEN
FILR
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
66
D.6.2
HERSTELLUNG
DER
PPK-PROMOTORVERKUERZUNGSVARIANTEN
.
71
D.6.3
PROMOTORAKTIVITAETSANALYSE
DER
PPK-PW
.
72
D.7
CHARAKTERISIERUNG
DES
INTRON
1
BEREICHS
.
75
D.7.1
ANALYSE
DER
POTENTIELLEN
TF-BINDUNGSSTELLEN
IM
INTRON
1
DES
PPK-GENS
.
75
D.7.2
REPORTERGEN-ANALYSE
DES
PPK-INTRON
1
BEREICHS
.
79
E
D
ISKUSSION
.
82
E.L
EXPRESSION
DER
MRNAS
VON
PPK,
FXII,
FXI,
HK
UND
LK
IN
HUMANEN
GEWEBEN
.
82
E.2
STIMULATION
VON
HEPG2-ZELLEN
MIT
LIPOPOLYSACCHARIDEN
(LPS)
.
84
E.3
ZELLSTIMULATION
VON
HEPG2-ZELLEN
MIT
PHORBOL-12-MYRISTAT-13-ACETAT
(PMA)
.
85
E.4
BESTIMMUNG
DER
MRNA-STABILITAETEN
VON
PPK
UND
GAPDH
.
86
E.5
ANALYSE DES
PPK-TRANSKRIPTIONSSTARTS
MITTELS
DER
RLM-RACE
METHODE
.
87
E.6
CONSENSUS-SEQUENZEN
FILR
DIE
TRANSKRIPTIONSINITIATION
.
89
E.7
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
P-1729
PROMOTORREGION
.
90
E.8
PROMOTOR-ANALYSE
DES
INTRON-L-BEREICHES
IN
HEK
293
ZELLEN
.
93
E.9
ANALYSE DES
P-1729
PROMOTORBEREICHES
IN
HEK
293
ZELLEN
.
95
E.10
AUSBLICK
.
96
F
L
ITERATURVERZEICHNIS
.
97
D
ANKSAGUNG
.
109
L
EBENSLAUF
.
111
P
UBLIKATIONSLISTE
.
112 |
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