Biosynthese des Thomsen-Friedenreich-Epitops in Tumorzellen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2002
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1
INH ALTS VERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
4
1 ZUSAMMENFASSUNG
5
2 EINLEITUNG 6
2.1 GLYKOPROTEINE
7
2.2 O-GLYKOPROTEINE 8
2.2.1 STRUKTUR DER O-GLYKANE 10
2.2.2 BIOSYNTHESE DER O-GLYKANE 12
2.2.2.1 EINFLUSSFAKTOREN AUF DIE BIOSYNTHESE DER O-GLYKANE 12
2.2.2.2 INITIALSCHRITT DER O-GLYKANBIOSYNTHESE 14
2.2.2.3 BILDUNG DER CORE-STRUKTUREN 15
2.2.2.4 KETTENVERLAENGERUNG UND BILDUNG TERMINALER STRUKTUREN 17
2.3 DAS THOMSEN-FRIEDENREICH-EPITOP 18
2.4 TF-SPEZIFISCHE LEKTINE UND ANTIKOERPER 21
2.5 AN DER BIOSYNTHESE DES TF-EPITOPS BETEILIGTE GLYKOSYLTRANSFERASEN
22
2.5.1 SIALYLTRANSFERASEN 22
2.5.1.1 SIALYLTRANSFERASE ST3GAL-I 23
2.5.1.2 SIALYLTRANSFERASE ST3GAL-EI 24
2.5.1.3 SIALYLTRANSFERASE ST6GALNAC-II 24
2.5.2 N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE C2GNT - 25
2.6
ZIELSETZUNG 26
3 MATERIAL UND METHODEN 27
3.1 MATERIAL 27
3.1.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 27
3.1.2 KULTURMEDIEN, SEREN UND ANTIBIOTIKA 28
3.1.3 ANTIKOERPER UND LEKTINE 28
3.1.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE KITS 28
3.1.5 WEITERE MATERIALIEN 29
3.1.6 GERAETE 29
3.1.7 ERWORBENE UND TRANSFIZIERTE ZELLLINIEN 30
3.1.8 LOESUNGEN UND PUFFER 31
3.1.9 PATIENTEN UND GEWEBEPROBEN 32
3.2 METHODEN
33
3.2.1 GENERELLE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 33
3.2.1.1 PHENOL/CHLOROFORM EXTRAKTION 33
3.2.1.2 PRAEZIPITATION VON NUKLEINSAEUREN 33
3.2.1.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 33
3.2.1.4 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 34
3.2.1.5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 34
3.2.2 IMMUNOHISTOCHEMIE 35
3.2.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 35
3.2.4 RT-PCR DER GLYKOSYLTRANSFERASEN 37
3.2.4.1 RNA-EXTRAKTION 37
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2
3.2.4.2 CDNA-SYNTHESE 37
3.2.4.3 SEMIQUANTITATIVE PCR 38
3.2.4.4 KOMPETETIVE PCR MIT MIMIC-STANDARD 39
3.2.5 KULTIVIERUNG VON HUMANEN TUMORZELLEN 40
3.2.6 KLONIERUNG 41
3.2.6.1 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 41
3.2.6.2 LIGATION 41
3.2.6.3 TOPO-KLONIERUNG 42
3.6.2.4 KLONIERUNG DER C2GNT 43
3.2.6.5 KLONIERUNG DER STOEGALNAC II 44
3.2.6.6 TRANSFORMATION IN E. COLI 44
3.2.6.7 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 44
3.2.7 TRANSFEKTION HUMANER KOLONKARZINOMZELLEN 45
3.2.7.1 TRANSFEKTION UND SELEKTION 45
32
.
1.2 NACHWEIS EINER ERFOLGREICHEN TRANSFEKTION MIT HILFE DER RT-PCR 46
3.2.8 BEHANDLUNG MIT ANTISENSE-OLIGODESOXYNUKLEOTIDEN 47
3.2.9 FACS-ANALYSE 48
3.2.10 REINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE 48
3.2.11 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAET 49
3.2.12 STATISTISCHE ANALYSE 51
4 ERGEBNISSE 52
4.1 GLYKOSYLTRANSFERASE-EXPRESSION IM HUMANEN KOLONKARZINOM 52
4.1.1 IMMUNOHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES TF-EPITOPS 52
4.1.2 EXPRESSION DER GLYKOSYLTRANSFERASEN 53
4.1.2.1 SEMIQUANTITATIVE RT-PCR 53
4.1.2.2 KOMPETETIVE PCR MIT MIMIC-STANDARD 57
4.1.2.3 NACHWEIS VON C2GNT IM KOLON GESUNDER PERSONEN 58
4.1.2.4 ENZYMAKTIVITAET 58
4.1.3 VERGLEICH DER GLYKOSYLTRANSFERASE-EXPRESSION MIT DER EXPRESSION
DES
TF-EPITOPS 59
4.1.4 VERGLEICH DER GLYKOSYLTRANSFERASE-EXPRESSION MIT
HISTOPATHOLOGISCHEN
PARAMETERN 60
4.1.5 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN EXPRESSION DER ST6GALNAC-II UND DER
UEBERLEBENSRATE DER PATIENTEN 62
4.2 MANIPULATION DER GLYKOSYLTRANSFERASE-EXPRESSION IN KULTIVIERTEN
KOLONKARZINOMZELLEN 64
4.2.1 UEBEREXPRESSION DER ST3GAL-I 64
4.2.1.1 GLYKOSYLTRANSFERASE-MRNA-EXPRESSION IN DEN ZELLLINIEN ST3-IA UND
ST3-IB 64
4.2.1.2 MESSUNG DER ENZYMAKTIVITAET ZUM NACHWEIS DER REKOMBINANTEN
ST3GAL-I 66
4.2.1.3 VERGLEICH VON MRNA-EXPRESSION UND
A2,3-SIALYLTRANSFERASEAKTIVITAET 67
4.2.1.4 EXPRESSION DES TF-EPITOPS AN DER ZELLOBERFLAECHE 67
4.2.2 HEMMUNG DER ST3GAL-I-EXPRESSION DURCH ANTISENSE-BEHANDLUNG 69
4.2.2.1 ANTISENSE-OLIGODESOXYNUKLEOTIDE 69
4.2.2.2 EXPRESSION VON ST3GAL-I-ANTISENSE-MRNA 69
4.2.3 UEBEREXPRESSION DER ST3GAL-H 71
4.2.3.1 GLYKOSYLTRANSFERASE-MRNA-EXPRESSION IN DER ZELLLINIE ST3-II 72
4.2.3.2 EXPRESSION DES TF-EPITOPS AN DER ZELLOBERFLAECHE DER ZELLLINIE
ST3-II 73
4.2.4 UEBEREXPRESSION DER ST6GALNAC-H 74
4.2.4.1 GLYKOSYLTRANSFERASE-MRNA-EXPRESSION IN DER ZELLLINIE ST6 74
3
4.2A.2
MESSUNG DER ENZYMAKTIVITAET ZUM NACHWEIS DER REKOMBINANTEN
ST6GALNAC-H IN DER ZELLLINIE ST6 75
4.2.4.3 EXPRESSION DES TF-EPITOPS AN DER ZELLOBERFLAECHE DER ZELLLINIE
ST6 76
4.2.4.4 GLYKOSYLTRANSFERASE-MRNA-EXPRESSION IN DER ZELLLINIE ST6LS 77
4.2.4.5 EXPRESSION DES TF-EPITOPS AN DER ZELLOBERFLAECHE DER ZELLLINIE
ST6LS 78
4.2.5 UEBEREXPRESSION DER C2GNT 79
4.2.5.1 GLYKOSYLTRANSFERASE-MRNA-EXPRESSION IN DER ZELLLINIE C2 79
4.2.5.2 EXPRESSION DES TF-EPITOPS AN DER ZELLOBERFLAECHE DER ZELLLINIE C2
81
5 DISKUSSION
82
6 AUSBLICK
88
7
LITERATUR
89
8 DANKSAGUNG 98 |
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