Epitop-Blocking-Immunoassays für den spezifischen Nachweis von Alphavirus-Genus-, WEEV-Serokomplex- und EEEV-Serokomplex-spezifischen Antikörpern:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
-1
2.
SCHRIFTTUM
-2
2.1.
EQUINE
ENZEPHALITIS
VIREN
-
2
2.1.1.
TAXONOMIE,
AUFBAU
UND
REPLIKATION
-
2
2.1.2.
WESTERN
EQUINE
ENCEPHALITIS
VIRUS
(WEEV)
-
5
2.1.2.1.
ALLGEMEINES
-
5
2.1.2.2.
EPIDEMIOLOGIE
-
5
2.1.2.3.
HUMAN
UND
VETERINAERMEDIZINISCHE
BEDEUTUNG
-
6
2.1.3.
EASTEM
EQUINE
ENCEPHALITIS
VIRUS
(EEEV)
-
6
2.1.3.1.
ALLGEMEINES
-
6
2.1.3.2.
EPIDEMIOLOGIE
-
6
2.I.3.3.
HUMAN
UND
VETERINAERMEDIZINISCHE
BEDEUTUNG
-
7
2.1.4.
VENEZUELAN
EQUINE
ENCEPHALITIS
VIRUS
(VEEV)
-
8
2.1.4.1.
ALLGEMEINES
-
8
2.I.4.2.
EPIDEMIOLOGIE
-
8
2.1.4.3.
HUMAN
UND
VETERINAERMEDIZINISCHE
BEDEUTUNG
-
9
2.2.
IMMUNOGENE
DER
ALPHAVIREN
-
10
2.2.1.
EINFUEHRUNG
-10
2.3.
ANTIGENETISCHE
STRUKTUR
DER
EL
UND
E2-GLYKOPROTEINE
-11
2.3.1.
EL
VON
WEEV
(MCMILLAN)
-
12
2.3.2.
E2
UND
EL
VON
VEEV
-
14
2.3.3.
EL
UND
E2
VON
EEEV
-
16
2.4.
PATHOGENESE
UND
IMMUNANTWORT
-
18
2.4.1.
IMMUNOLOGISCHE
BEDEUTUNG
VON
INTERFERON
OC/SS
BEI
ALPHAVIRALEN
INFEKTIONEN
-
19
2.4.2.
ZELLULAERE
IMMUNITAET
-
20
2.4.3.
HUMORALE
IMMUNANTWORT
-
20
2.5.
SEROLOGISCHE
DIAGNOSTIK
VON
INFEKTIONEN
MIT
PFERDEENZEPHALITIDEN
-
21
2.5.1.
PLAQUEREDUKTIONSNEUTRALISATIONSTEST
(PRNT)
-21
2.5.2.
HAEMAGGLUTINATIONSINHIBITIONSTEST
(HI)
-
22
2.5.3.
IGG
UND
IGM-CAPTURE-ELISA
-
22
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
-
23
3.1.
VIRALE
RNA
-23
3.2.
AMPLIFIKATION
DER
VIRALEN
GENE
-
24
3.2.1.
AUSWAHL
DER
PRIMER
-
24
3.2.2.
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
UND
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
-
24
3.3.
EXPRESSIONSVEKTOREN
-
27
3.3.1.
PSINREP
5-27
3.3.2.
PCDNA3.1
-28
3.3.3.
TOPO-TA-CLONING-KIT
-
29
3.4.
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
IN
VERSCHIEDENE
EXPRESSIONSVEKTOREN
-
30
3.4.1.
AGAROSEGEL-AUFREINIGUNG
VON
RT-PCR-AMPLIFIKATEN
UND
KLONIERUNG
IN
TOPO-TA-VEKTOR
-
30
3.4.2.
TRANSFORMATION
DER
BAKTERIEN
UND
PLASMID-DNA-GEWINNUNG
-
30
3.4.3.
LIGATION
DER
INSERT
UND
VEKTOREN-DNA
-
31
3.5.
TRANSFEKTION
DER
ZELLEN
-
31
3.5.1
PERMANENTE
ZELLINIE
-
31
3.5.1.1
TRANSFEKTION
DER
RK-1
3
ZELLEN
MIT
PCDNA3.
1
-VEKTOR
-
31
3.5.1.2.
SELEKTION
POSITIVER
ZELLEN
-
32
3.5.1.3.
KONTROLLE
DER
PROTEINEXPRESSION
-
33
3.5.1.4.
SUBKLONIERUNG
POSITIVER
ZELLKLONE
-
33
3.5.2.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
SINDBIS-VIREN
-
34
3.5.2.1.
LINEARISIERUNG
VON
PLASMID-DNAS
-
34
3.5.2.2.
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
VON
PLASMID-DNA
-
34
3.5.2.3.
KO-TRANSFEKTION
VON
BHK-21-ZELLEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
-
34
3.5.2.4.
PRODUKTION
VON
REKOMBINANTEN
SINDBIS
VIREN
-
35
3.5.2.5.
KONTROLLE
DER
PROTEINEXPRESSION
-
35
3.6.
SERA
-
36
3.7.
EPITOP-BLOCKING-IMMUNOFLUORESZENZ-INHIBITIONSASSAYS
(EBIFIA)
-
37
3.7.1.
VORBEREITUNG
DER
ZELLEN
FUER
DIE
SEROLOGISCHEN
TESTS
-
37
3.7.2.
MESSUNGEN
IM
FACSCAN
(FLUORESCENCE
ACTIVATED
CELL
SORTER)
-
38
4,
ERGEBNISSE
-
41
4.1.
AMPLIFIKATION
DER
VIRALEN
GENE
MITTELS
RT-PCR
-
41
4.2.
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
IN
DEN
PCR*
2.1
TOPO-TA-VEKTOR
-
42
4.3.
PERMANENTE
ZELLINIE
-
42
4.3.1.
KLONIERUNG
DER
VIRALEN
GENE
IN
DEN
PCDNA3.1-VEKTOR
-42
4.3.2.
TRANSFEKTION
UND
SELEKTION
POSITIVER
RK-13-ZELLEN
-
43
4.4.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
SINDBIS-VIREN
-
44
4.4.1.
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
IN
DEN
SINDBIS-VEKTOR
SOWIE
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
DER
VEKTOR-INSERT-DNA
UND
DER
"HELPER-DNA"
-
44
4.4.2.
KO-TRANSFEKTION
VON
BHK-21-ZELLEN
MIT
PSINREPNHS
UND
DH-EB-RNA
MITTELS
ELEKTROPORATION
-
44
4.4.3.
KONTROLLE
DER
PROTEINEXPRESSION
-
46
4.4.3.1.
ANTIGENNACHWEIS
IM
FACSCAN
-
46
4.4.3.2.
ANTIGENNACHWEIS
MITTELS
IF-MIKROSKOPIE
-
47
4.5.
EPITOP-BLOCKING-IMMUNOFLUORESZENZINHIBITIONS-ASSAYS
(EBIFIA)
MITTELS
FACSCAN
-
48
4.5.1.
NACHWEIS
VON
ALPHAVIRUS-GENUS-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
MITTELS
EPITOP-BLOCKING-IMMUNOFLUORESZENZINHIBITIONS-ASSAY
(EBIFIA)
-
48
4.5.2.
NACHWEIS
VON
WEEV-KOMPLEX-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
MITTELS
EPITOP-BLOCKING-IMMUNOFLUORESZENZINHIBITIONS-ASSAY
(EBIFIA)
-
49
4.5.3.
NACHWEIS
VON
EEEV-KOMPLEX-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
MITTELS
EPITOP-BLOCKING-IMMUNOFLUORESZENZINHIBITIONS-ASSAY
(EBIFIA
-
50
5.
DISKUSSION
-
52
5.1.
HERSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
ANTIGENE
UND
TESTUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
(MAB'S)
-
52
5.1.1.
ANTIGENEXPRESSION
MIT
PCDNA3
.1
-
VEKTOR
UND
KONTROLLE
DER
ANTIGENPRODUKTION
DURCH
IF-FAERBUNG
MIT
SPEZIFISCHEN
MAB'S
-
52
5.1.2.
ANTIGENEXPRESSION
MIT
PSINREP5
UND
DH-EB
UND
KONTROLLE
DER
ANTIGENPRODUKTION
DURCH
IF-FAERBUNG
MIT
SPEZIFISCHEN
MAB'S
-
53
5.2.
EPITOP-BLOCKING-IMMUNOFLUORESZENZINHIBITIONS-ASSAYS
(EBIFIA)
-
54
5.2.1.
NACHWEIS
VON
ALPHAVIRUS-GENUS-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
MITTELS
EBIFIA
-54
5.2.2.
NACHWEIS
VON
WEEV-SEROKOMPLEX-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
MITTELS
EBIFIA
-
55
5.2.3.
NACHWEIS
VON
EEEV-SEROKOMPLEX-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
MITTELS
EBIFIA
-
57
6.
ZUSAMMENFASSUNG
-
59
7.
SUMMARV
-
60
8.
MATERIALLISTE
-
61
8.1.
GERAETE
-
61
8.2.
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
-
61
8.3.
ENZYME
-
62
8.4.
KOMMERZIELLE
KITS
-
63
8.5.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
-
63
9.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
-
65
10.
LITERATURVERZEICHNIS
-
68 |
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