Lokalisation der Bindungsstelle für Sulfonylharnstoffe auf Sulfonylharnstoffrezeptoren:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2001
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AE8O F- 3 3T 7-
LOKALISATION DER BINDUNGSSTELLE FUER
SULFONYLHARNSTOFFE AUF SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN
VON DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER TECHNISCHEN
UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA
ZU BRAUNSCHWEIG
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
(DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE
DISSERTATION
VON
ANDREAS TOMAN
AUS
ROSTOCK
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN VE
1 EINLEITUNG 1
1.1 THERAPIE DES TYP-II-DIABETES 1
1.2 SULFONYLHARNSTOFFE 1
1.2.1 ENTWICKLUNG UND STRUKTUR DER SULFONYLHARNSTOFFE 1
1.2.2 WIRKMECHANISMUS 3
1.3 K ATP-KANAELE 4
1.3.1 STRUKTUR 4
1.3.2 K ATP-KANAL DER B-ZELLE 6
1.3.2.1 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG 6
1.3.2.3 PHHI ALS FOLGE REDUZIERTER OFFENWAHRSCHEINLICHKEIT VON SUR1/K,
R6.2-KANAELEN 6
1.3.3 K ATP-KANAL IN NEURONEN 7
1.3.4 K ATP-KANAL IM HERZ- UND SKELETTMUSKEL 8
1.3.5 K ATP-KANAL IN GLATTER MUSKULATUR 8
1.4 KALIUM-KANAL-OEFFNER 9
1.4.1 DIAZOXID 10
1.4.2 PINACIDIL 11
1.4.3 WEITERE KALIUM-KANAL-OEFFNER 11
1.4.4 THERAPEUTISCHE BEDEUTUNG DER KALIUM-KANAL-OEFFNER 12
1.5 SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN 13
1.5.1 NACHWEIS IN GEWEBEN 13
1.5.2 KLONIERUNG DES SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORS 14
1.5.3 SURS SIND ABC-PROTEINE 14
1.5.4 PHARMAKOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER SULFONYLHARN-
STOFFREZEPTOREN 16
1.5.4.1 AFFINITAET VON SULFONYLHARNSTOFFEN UND MEGLITINID 16
1.5.4.2 AFFINITAET VON KALIUM-KANAL-OEFFNERN 17
1.6 LOKALISATION DER BINDUNGSSTELLEN FUER SULFONYLHARNSTOFFE UND KALIUM-
KANAL-OEFFNER 18
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 KULTIVIERUNG, PASSAGIERUNG UND KONSERVIERUNG VON COS7-ZELLEN
3.1.1 LOESUNGEN UND MEDIEN 3.1.2 KULTIVIERUNG VON COS7-ZELLEN 3.1.2.1
UMSETZEN DER ZELLEN (PASSAGIEREN) 3.1.2.2 KRYOKONSERVIERUNG VON
COS7-ZELLEN
3.2 HERSTELLUNG DER MUTATIONEN
3.2.1 LOESUNG FUER DIE MUTATIONEN 3.2.2 DURCHFUEHRUNG DES QUIKCHANGE*
SITE-DIRECTED MUTAGENESIS - VERFAHRENS 3.2.2.1 VERWENDETE PLASMIDE
3.2.2.2 DESIGN DER OLIGONUKLEOTID-PRIMER 3.2.2.3 AUSFUEHRUNG DER PCR
3.2.3 KONTROLLE DES PCR-PRODUKTS
3.3 BAU DER CHIMAEREN
3.3.1 PLANUNG DER CHIMAEREN 3.3.2 FERTIGUNG DER CHIMAEREN
3.4 ERZEUGUNG DER DELETIONSMUTANTEN
3.4.1 DELETION EINZELNER AMINOSAEUREN 3.4.2 C-TERMINALE DELETIONEN 3.4.3
N-TERMINALE DELETIONEN UND DELETIONEN INNERHALB DER TMDI, TMDII ODER
NBF1 VON CHIMAERE M
3.5 SEQUENZIERUNGEN
3.6 TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION
3.6. 1 LOESUNGEN FUER TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 3.6.2
HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN 3.6.3 DURCHFUEHRUNG DER
TRANSFORMATION 3.6.4 PLASMIDPRAEPARATION
19
20
20
20 21 21 22
22
22
23 23 23 24
25
25
25 26
26
26 26
27
27
31
31 34 34 35
3.7 TRANSFEKTION
3.7. 1 LOESUNGEN FUER DIE TRANSFEKTION 3.7.2 TRANSFEKTION MITTELS
DEAE-DEXTRAN-METHODE 3.7.3 HISTOLOGISCHE LAC Z-FAERBUNG 3.7.3.1 LOESUNGEN
3.7.3.2 FAERBUNG 3.7.3.3 AUSWERTUNG
3.8 MEMBRANPRAEPARATION
3.8.1 LOESUNGEN
3.8.2 PRAEPARATION VON MEMBRANEN AUS COS7-ZELLEN
3.9 PROTEINBESTIMMUNG
3.9.1 LOESUNGEN
3.9.2 DURCHFUEHRUNG DER PROTEINBESTIMMUENG
3.10 BINDUNGSEXPERIMENTE AN COS-MEMBRANEN
3.10.1 LOESUNG FUER DIE BINDUNGSEXPERIMENTE 3.10.1.1 LOESUNGEN DER
RADIOLIGANDEN 3.10.1.2 STAMMLOESUNGEN DER EINGESETZTEN TESTSUBSTANZEN
3.10.1.3 LOESUNGEN DER NUKLEOTIDE
3.10.2 VORBEREITUNG DER MEMBRANEN 3.10.3
GLEICHGEWICHTSBINDUNGSEXPERIMENTE 3.10.3.1 PRINZIP DES FILTRATIONSASSAYS
3.10.3.2 INKUBATIONEN 3.10.3.2.1 DISSOZIATIONEN 3.10.3.2.2
VERDRAENGUNGSBINDUNGSEXPERIMENTE BEI GLEICHGEWICHTSBIN-
DUNG
3.10.3.3 FILTRATION UND SZINTILLATIONSZAEHLUNG 3.11 DATENAUSWERTUNG
3.11.1 3.11.2 3.11.3 3.11.4
3.11.5 3.11.6
STATISTIK SPEZIFISCHE BINDUNG DISSOZIATIONSKINETIKEN
GLEICHGEWICHTSBINDUNGEN DISSOZIATIONSKONSTANTEN
VERDRAENGUNG
35
35 37 38 38 39 40
40
40 41
42
42
42
42
42 43 43 44
45 45 45 45 46
46
47
47
47 47 48 48
49 49
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
4
4.1
4.2
ERGEBNISSE
IDENTIFIKATION VON BEREICHEN DES SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORS MIT KRITI-
SCHER BEDEUTUNG FUER DIE BINDUNG VON SULFONYLHARNSTOFFEN
DOMAENEN TMDO -
4.1.1 EINFUEHRUNG
4.1.2 UNTERSUCHUNG DER TRANSMEMBRANAEREN TMDUE 4.1.3 BEDEUTUNG
C-TERMINALER TRANSMEMBRANAERER REGIONEN INNERHALB DER TMDII
4.1.4 UNTERSUCHUNG WEITERER BEREICHE INNERHALB DER TMDII
4.1.5 114 AMINOSAEUREN DES SUR1 UEBERTRAGEN HOHE AFFINITAET FUER DIE
BINDUNG VON GLIBENCLAMID AUF SUR2A
UNTERSUCHUNGEN AN CHIMAEREN REZEPTOREN MIT HOHER AFFINITAET FUER DIE
BINDUNG VON SULFONYLHARNSTOFFEN UND KALIUM-KANAL-OEFFNERN
4.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER BINDUNGSEIGENSCHAFTEN DER CHIMAERE M
4.2.2 ALLOSTERISCHE INTERAKTION VON GLIBENCLAMID UND P1075 AN
CHIMAERE M
4.2.3 KINETIKEN FUER DIE DISSOZIATION VON GLIBENCLAMID UND P1075 AN
CHIMAERE M
4.2.3.1 EINFLUSS VON PINACIDIL AUF DIE KINETIK DER DISSOZIATION DES
KOMPLEXES ZWISCHEN CHIMAERE M UND [ 3H]GLIBENCLAMID 4.2.3.2 EINFLUSS VON
GLIBENCLAMID AUF DIE KINETIK DER DISSOZIATION DES KOMPLEXES ZWISCHEN
CHIMAERE M UND [ 3H]P1075
4.2.4 EINFLUSS DES CARBOXY-TERMINUS AUF DIE NEGATIV-ALLOSTERISCHE
KOPPLUNG DER BINDUNGSSTELLEN FUER SULFONYLHARNSTOFFE UND KA-
LIUM-KANAL-OEFFNER 4.2.4.1 NEGATIV-ALLOSTERISCHE BEEINFLUSSUNG DER
BINDUNG VON
[ 3H]P1075 DURCH GLIBENCLAMID AN DEN CHIMAEREN N UND O 4.2.4.2
NEGATIV-ALLOSTERISCHE BEEINFLUSSUNG DER BINDUNG VON [ 3H]GLIBENCLAMID
DURCH PINACIDIL AN DEN CHIMAEREN N UND O 4.2.5 - AMINOSAEUREN IM
C-TERMINUS DES SUR BEEINFLUSSEN DIE NEGA-
TIV-ALLOSTERISCHE KOPPLUNG DER HOCHAFFINEN BINDUNGSSTELLEN 4.2.5.1
VERDRAENGUNG VON [ 3H]P1075 DURCH GLIBENCLAMID AN CHIMAE- RE O MIT
PUNKTMUTATIONEN IM C-TERMINUS 4.2.5.2 VERDRAENGUNG VON [ 3H]GLIBENCLAMID
DURCH PINACIDIL AN CHIMAE-
RE O MIT PUNKTMUTATIONEN IM C-TERMINUS
50
50
50
50
53 54
56
57
57
59
60
60
63
64
66
67
68
69
70
4.3 UNTERSUCHUNG DER SULFONYLHARNSTOFF-BINDENDEN REGION VON SURS 71
4.3.1 EINFUEHRUNG 71
4.3.2 EINE PUNKTMUTATION INNERHALB DER SULFONYLHARNSTOFF-
BINDENDEN REGION VON SURS BEEINFLUSST DIE BINDUNGSEIGEN- SCHAFTEN FUER
SULFONYLHARNSTOFFE 71
4.3.3 DIE AFFINITAET VON SURS FUER GLIBENCLAMID WIRD DURCH DIE GROE- SSE DER
AMINOSAEURE IN POSITION 1238 BZW. 1205 BEEINFLUSST 77 4.3.4 DELETION DER
AMINOSAEURE IN POSITION 1205 VON SUR2A INDU- ZIERT EINE STARKE ABNAHME
DER AFFINITAET FUER DIE BINDUNG VON
GLIBENCLAMID UND MEGLITINID 8 1
4.4 UNTERSUCHUNG VON SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN DURCH DELETIONSANALY-
SEN 82
4.4.1 EINFUEHRUNG 82
4.4.2 DELETIONEN IM BEREICH DER TMDII VON SUR 1 82
4.4.3 DELETIONEN IM BEREICH DES N-TERMINUS VON CHIMAERE M 84
4.4.4 DELETION EINZELNER REGIONEN INNERHALB DER TMDI, TMDII ODER NBF1
VON CHIMAERE M 86
4.4.5 KOMBINIERTE DELETION N- UND C-TERMINALER BEREICHE DES SUR 86
IV
|
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