Untersuchungen von Hämozyten von Mytilus edulis L.:
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| Sprache: | German |
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 HAEMOLYMPHE 2
1.2 HAEMOZYTEN 3
1.2.1 ZELLTYPEN IN DER HAEMOLYMPHE 5
1.2.2 ONTOGENESEMODELLE 7
1.2.2.1 MODELLL 7
1.2.2.2 MODELL II 8
1.2.2.3 MODELL III 10
1.3 UNTERSUCHUNG DER ZIRKULIERENDEN HAEMOZYTEN 13
1.4 ZELLKULTUR 14
1.5 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 16
2. MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 17
2.2 LABORGERAETSCHAFTEN UND MATERIALIEN 19
2.3 PUFFERLOESUNGEN, KULTURMEDIEN _ 20
2.3.1
MYTILUS
RINGER 20
2.3.2 GLUCOSE RINGER 20
2.3.3 HBS (HEPES GEPUFFERTE SALZLOESUNG) 20
2.3.4 PBS (PHOSPHAT GEPUFFERTE SALZLOESUNG) 20
2.3.5 TMBS (TRIS/MALEAT GEPUFFERTE SALZLOESUNG) 21
2.3.6 HAEMOZYTEN KULTURMEDIUM 21
2.3.7 CARBONATPUFFER 22
2.3.8 TBS (TRIS GEPUFFERTE SALZLOESUNG) 22
2.4 FAERBUNGEN 22
2.4.1 VITALFARBUNG MIT TRYPANBLAU 22
2.4.2 MAY GRUENWALD FAERBUNG (MGW) 22
2.4.2.1 FIXIERUNG BEI HAEMOLYMPHABNAHME 22
2.4.2.2. FIXIERUNG DER ZELLEN AUS KULTUREN 23
2.4.2.3 FAERBEREIHE 23
2.4.3 PROLIFERATIONSTEST MIT BRDU 24
2.4.4 SILBERFAERBUNG VON POLYACRYLAMID-GELEN 25
2.5 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 26
2.5.1 FIXIERUNG 26
2.5.1.1 GLUTARALDEHYD FIXIERUNG 26
2.5.1.2 NACHFIXIERUNG MIT OSUE
4
27
2.5.1.3 OSMIUMFIXIERUNG 27
2.5.2 EINBETTUNG DER ZELLEN / 27
2.5.3 SCHNEIDEN FAERBEN KONTRASTIEREN 28
2.5.3.1 SEMIDUENNSCHNITTE 28
2.5.3.2 ULTRADUENNSCHNITTE, KONTRASTIERUNG 29
2.6 VERSUCHSTIER UND HAEMOLYMPHABNAHME 29
2.6.1 VERSUCHSTIER 29
2.6.2 HAEMOLYMPHENTNAHME 30
2.6.2.1 KEIMARME HAEMOLYMPHPROBEN 30
2.7 ZELLKULTURVERSUCHE 30
2.7.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR AUSWIRKUNG VON MEDIUMSZUSAETZEN 31
2.7.1.1 ANTIBIOTIKA 31
2.7.1.2 AMINOSAEUREN/ATP 32
2.7.1.3 GONADENEXTRAKT/SERUM VONM
EDULIS/FCS/TCM
33
2.7.1.4 VITAMINE 35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/964117193
2.7.1.5 L15/MEM 35
2.7.2 AUSWIRKUNG DER OSMOLARITAET UND DES PH-WERTES 36
2.7.3 KULTURVERSUCHE MIT SUBSTRATEN ALS BESCHICHTUNG DER KULTURSCHALEN
36
2.7.3.1 AFFMITAETSCHROMATOGRAPHIE ZUR GEWINNUNG VON
GELATINE-BINDENDEN MOLEKUELEN AUS M. EDULIS SERUM 36
2.7.3.2 GELELEKTROPHORETISCHE UNTERSUCHUNG DES ELUATS 38
2.7.3.3 BESCHICHTUNG DER KULTURSCHALEN 39
2.13 A
ANSATZ DER ZELLKULTUREN 39
2.7.3.5 AUSWERTUNG DER ZELLKULTUREN IN BESCHICHTETEN KULTURSCHALEN 41
2.7.4 LANGZEITKULTUREN 41
2.7.5 ANREICHERUNGSKULTUREN 42
2.7.5.1 ANREICHERUNGSKULTUREN NACH PERCOLL GRADIENTENZENTRIFUGATION 42
2.7.5.2 FICOLL GRADIENTENZENTRIFUGATION 44
2.8 EXPERIMENTE MIT MITOGENEN 47
2.8.1 INJEKTIONSVERSUCHE
(IN VIVO MITOGENITAET) 47
2.8.1.1. HERSTELLUNG DER INJEKTIONSLOESUNGEN 48
2.8.1.2 BEPROBUNG UND INJEKTION 48
2.8.1.3 BEHANDLUNG DER ZELLPROBEN 49
2.8.1.4 AUSWERTUNG 50
2.8.2 KULTURVERSUCHE
(IN VITRO MITOGENITAET) 50
2.9 AGGLUTINATIONS UND ABSORPTIONSTEST 51
2.9.1 GEWINNUNG DER KANINCHENERYTHROZYTEN 51
2.9.2 GEWINNUNG UND AUFBEREITUNG DES SERUMS VON
M. EDULIS 51
2.9.3 AGGLUTINATIONSTEST 52
2.9.4 WGA ABSORPTIONSTEST 52
2.10 PROLIFERATIONSTEST
IN VIVO MIT NACHFOLGENDER GRADIENTENZENTRIFUGATION 53
2.10.1 VORBEHANDLUNG DER VERSUCHSTIERE 53
2.10.2 MARKIERUNG DER HAEMOZYTEN 54
2.10.3 GEWINNUNG UND AUFBEREITUNG DER ZELLPROBEN 54
2.10.4 GRADIENTENZENTRIFUGATION 54
2.10.5 REINIGUNG DER ZELLFRAKTIONEN 54
2.10.6 HERSTELLUNG VON ZELLPRAEPARATEN 5 5
2.10.7 AUSWERTUNG 55
2.11 ZELL-MIGRATIONSEXPERIMENTE 5 5
2.11.1 ZUFAELLIGE MIGRATION UND AGGREGATION
K 5 5
2.11.2 CHEMOTAXISEXPERIMENTE 56
2.11.2.1 AUFBAU DER CHEMOTAXIS-KAMMERN 56
2.11.2.2 GEWINNUNG DER CHEMOTAKTIKA 57
2.11.2.3 BESCHICKEN UND ABEMTEN DER CHEMOTAXIS-KAMMERN 59
2.11.2.4 AUSWERTUNG 61
2.11.3 AGGREGATE IM AGAR LOCKVERSUCH 61
2.11.3.1 AUFBAU DER CHEMOTAXISKAMMEM NACH ZIGMOND 62
2.11.3.2 REINIGUNG UND BESCHICKUNG DER KAMMERN 63
2.11.3.3 AUSWERTUNG 64
3. ERGEBNISSE 65
3.1 ZELLTYPEN, POPULATIONSZUSAMMENSETZUNG UND ZELLDICHTE IN DER HAEMO-
LYMPHE VON M. EDULIS 65
3.1.1 STEIGERUNG DER ZELLZAHL 65
3.1.2 ABSENKUNG DER ZELLZAHL 67
3.1.2.1 LPS-INJEKTION 67
3.1.2.2 TNF-INJEKTION 70
3.2 PROLIFERATION 74
3.2.1 NACHWEIS VON ZELLTEILUNGEN 74
3.2.1.1
IN VIVO NACHWEIS VON ZELLTEILUNGEN 75
3.2.1.2
IN VITRO NACHWEIS VON ZELLTEILUNGEN 75
3.2.2 EXPERIMENTE ZUR UNTERSUCHUNG VON VERAENDERUNGEN DER HAEMOZYTEN-
PROLIFERATION 75
3.2.2.1 ANSATZ A: INKORPORATION VON BRDU
IN VIVO NACH 2H UND 20H 75
3.2.2.2 ANSATZ B: INKORPORATION VON BRDU IN VIVO NACH 18 H 79
3.2.2.3 ANSATZ C: INKORPORATION VON BRDU
IN VITRO NACH 2 UND 20 H 81
3.2.3 EINSATZ VON MITOGENEN IN VIVO 85
3.2.3.1LPS 85
3.2.3.2 VERLETZUNG DER TIERE 88
3.2.3.3 PNA/CON A 90
3.2 3.4 WGA 94
3.2.3.4 VERGLEICH DER AUSWIRKUNG VON RINGER, HBS ODER TBS 97
3.2.4 AGGLUTINATIONSTEST 98
3.2.5 WGA-ABSORPTIONSTEST 99
3.2.6 ZUWEISUNG DER PROLIFERATIONSAKTIVITAET (GRADIENTENZENTRIFUGATION)
100
3.3 MIGRATION 105
3.3.1 AUSWIRKUNG VON LPS 105
3.3.2 UNTERSUCHUNG DER AGGREGATION ~ 107
3.3.2.1 UNTERSUCHUNGEN AUF OBJEKTTRAEGERN IN KAMMERN MIT
EINFACHER MEMBRAN 107
3.3.2.2 EXPERIMENTE IN BOYDEN KAMMERN 107
3.3.2.3 EXPERIMENTE IN ZIGMOND KAMMERN 110
3.3.2.4 ZUSAMMENFASSUNG 111
3.4 ZELLKULTUR 112
3.4.1 STERILITAET 112
3.4.2 KULTURMEDIUM 113
3.4.2.1 AMINOSAEUREN 114
3.4.2.2 VITAMINE 114
3.4.2.3 PUFFERSUBSTANZEN UND SALZE 114
3.4.2.4 SERUM 115
3.4.2.5 GONADENEXTRAKT ALS SUPPLEMENT 119
3.4.2.6 EINSATZ VON SUBSTRATEN IN ZELLKULTUR 120
3.4.2.7 MITOGENTESTS
IN VITRO' 126
3.4.4 LANGZEITKULTUREN 128
3.4.4.1 ANSATZ I 128
3.4.4.2 ANSATZ II 134
3.4.4.3 ZELLKULTUREN UNTER UNPHYSIOLOGISCHEN BEDINGUNGEN 136
3.4.4.4 EINSATZ VON TPA 137
3.4.5 ANGEREICHERTE KULTUREN 138
3.4.5.1 NACH PERCOLLGRADIENTENZENTRIFUGATION 138
3.4.5.2 NACH FICOLLGRADIENTENZENTRIFUGATION 138
3.4.6 YYNEOPLASTISCHE" ZELLEN 140
3.4.6.1 UNTERSUCHUNG DER PROLIFERATION 140
3.4.6.2 LANGZEITKULTUR 141
3.4.6.3 INFEKTIONSVERSUCH 142
4. DISKUSSION 144
4.1 DEFINITION DER HAEMOZYTENTYPEN 144
4.2 ZUSAMMENSETZUNG DER HAEMOZYTENPOPULATION 145
4.3 ZELLDICHTE 146
4.4 ZUSAMMENHANG VON ZELLZAHLVERAENDERUNG UND POPULATIONSZUSAM
MENSETZUNG IN DER HAEMOLYMPHE 147
4.4.1 EINSATZ VON LPS 147
4.4.2 EINSATZ VON TNF-ALPHA 148
4.5 PROLIFERATION 152
4.5.1 SPEZIFITAET DES PROLIFERATIONSNACHWEISES 150
4.5.2 CHARAKTERISIERUNG DER PROLIFERIERENDEN ZELLEN IN ZIRKULATION:
GRADIENTEN-
TRIFUGATION 151
4.5.3 EINFLUSS DER METHODE DER BRDU APPLIKATION 153
4.5.4 ZUSAMMENHANG VON ZELLZAHL UND PROLIFERATION 153
4.5.5 VERAENDERUNG DER PROLIFERATIONSAKTIVITAET 154
4.6 MIGRATIONSVERSUCHE 158
4.7 ZELLKULTUR 160
4.7.1 STERILITAET 161
4.7.2 KULTURMEDIUM 161
4.7.3 AMINOSAEUREN 162
4.7.4 SERUM ODER SERUMERSATZ 162
4.7.5 BESCHICHTUNGEN 162
4.7.6 LANGZEITKULTUREN 164
4.8 ZUSAMMENFASSUNG UND SCHLUSS 167
BILDTAFELN I - XIV 171
LITERATUR 185 |
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