Bedeutung der anaeroben Nitratreduktase für die Pathogenese der Infektion mit Mycobacterium bovis BCG in immundefizienten (SCID) Mäusen:
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2001
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| adam_text | Titel: Bedeutung der anaeroben Nitratreduktase für die Pathogenese der Infektion mit Mycobacterium bovis B
Autor: Fritz, Christian
Jahr: 2001
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literahirübersicht 2
2.1 Mykobakterien 2
2.1.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie 2
2.1.2 Vorkommen 4
2.2 Tuberkulose beim Menschen 6
2.2.1 Epidemiologie 6
2.2.2 Än ologie und Pathogenese 7
2.2.3 Klinik und Pathologie 8
2.2.4 Diagnose 9
2.2.5 Impfung gegen die Tuberkulose 11
2.2.6 Therapie 14
2.3 Tuberkulose bei Haus-, Zoo- und Wildtieren 15
2.3.1 Vorkommen 15
2.3.2 Epizootiologie 16
2.3.3 Äüologie und Pathogenese 17
2.3.4 Klinik und Pathologie 18
2.3.5 Diagnose 20
2.3.6 Tiermodelle 21
2.4 Anaerober Stoffwechsel in obligat aeroben Bakterien 23
2.4.1 Dissimilatonsche Nitratreduktion 23
2.4 1.1 Die anaerobe Nitratreduktase(NarGHJl) 24
2.4.2 Assimilatorische Nitratreduktion 26
2.5 Anaerober Stoffwechsel in Mykobakterien 26
2.5.1 Anaerober Nitratstoffwechsel in Mykobakterien 27
2.5.1.1 Dissimilatonsche Nitratreduktion 28
2.5.1.2 Assimilatorische Nitraüreduktion 28
2.6 Zielsetzung der Arbeit 29
Material und Methoden 30
3.1 Material 30
3.1.1 Plasmide, Cosmide und Cosmid-Bibliotheken 30
3.1.2 Bakterienstämme 31
3.1.3 Nähimedien 31
3.1.4 Lösungen und Puffer 33
3.2 Methoden 35
3.2.1 Transformation von DNA in E. coli 35
3.2.2 Transformation von DNA in BCG und M. smegmatis 35
3.2.3 Präparation von Plasmid-DNA 36
3.2.4 Agarose-Get-Elektrophorese 36
3.2.5 Isolierung und Aufreinigung von DNA-Banden aus
Agarose-Gelen 37
3.2.6 Restriktionsspaltung 37
3.2.7 Dephosphorylierung linearisierter Vektor-DNA 38
3.2.8 Ligation 38
3.2.9 Kultivierung von M smegmatis 39
3.2.9.1 Keimdichte unter aeroben Bedingungen 39
3.2.9.2 Keimdicfate unter anaeroben Bedingungen 39
3.2.10 Kultivierung von BCG 40
3.2.10.1 Keimdicfate unter aeroben Bedindungen 40
3.2.10.2 Keiradichte unter anaeroben Bedingungen 40
3.2.11 Nitratreduktase-Test 40
3.2.12 Bestimmung der Keündichte 41
3.2.13 Anzucht und Aufbereitung des Infektionsmaterials 41
3.2.14 Tierexperiment 42
3.2.15 Infektion der Versuchstiere 42
3.2.16 Haltung der Versuchstiere 43
3.2.17 Versuchsaufbau 43
3.2.18 Tötung und Sektion der Versuchstiere 43
3.2.19 Aufarbeitung des Sektionsmaterials 44
3.2.20 Bestimmung der Keimdichte in den Organen 44
3.2.21 Pathologisch-histologische Untersuchung der Organe 45
3.2.21.1 Herstellung von Paraffinschrtitten 45
3.2.21.2 Ziehl-Neelsen-Färbung 46
3.2.21.3 Begutachtung der histologischen Präparate 47
3.2.22 Datenerfassung und statistische Auswertung 47
Ergebnisse 49
4.1 Funktion der dissimilatorischen Nitratreduktase narGHJI von
Mycobacterium tuberculosis in vitro 49
4.1.1 Anaerobe Nitratreduktaseaktivität von M smegmatis mc2 55
mit narGH//-tragenden Cosmiden 49
4.1.2 SubkJonierung von narGHJI von M tuberculosis
in mykobakterielle Shuttlevektoren 51
4.1.3 Transformation von narGHJI von M. tuberculosis
in M smegmatis 55
4.1.4 Analyse der Nitratreduktaseaktivität der
rekombinanten Klone 56
4.1.5 Kultivierung der «arG//7/-tragenden Klone
unter aeroben und unter anaeroben Bedingungen 58
4.2 Die anaerobe Nitratreduktaseaktivität von BCG in vitro 62
4.2.1 Analyse der Nitratreduktaseaktivität von BCG
unter aeroben und unter anaeroben Bedingungen 62
4.2.2 Analyse der anaeroben Nitratreduktaseaktivität
der JnorG-MutantevonBCG 63
4.2.3 Quantitative Analyse der Keimdichte von BCG
undderi*iarG-MutanteBCG 64
4.2.3.1 Keimdichte unter aeroben Bedingungen 64
4.2.3.2 Keimdichte von unter anaeroben Bedingungen 65
4.3 Komplemerrtation der ztnarG-Mutante von BCG mit narGHJI
von M. tuberculosis 66
4.3.1 Analyse der Nitratreduktaseaktivität der mit narGHJI
von M. tuberculosis komplementierten /4narG-Mutante von BCG 67
4.4 Vergleich einer ^norG-Deletionsmutante von BCG
mit BCG+ in immundefizienten SCID-Mäusen 69
4.4.1 Unterschiede in Überlebenszeiten von SCID- Mäusen,
die mit BCG+ bzw. der ^inarG-Mutante von BCG
infiziert wurden 69
4.4.1.1 Überlebenszeiten 69
4.4.1.2 Bakterienlast in Lunge und Leber 70
4.4.1.3 Pathohistologische Untersuchung der Leber 72
4.4.1.4 Pathohistologische Untersuchung der Lunge 74
4.4.2 Wachstum der /toarG-Mutante von BCG (IW1)
in immundefizienten SCID-Mäusen im Vergleich
zum BCG-Wildtyp 76
4.4.2.1 Quantitative Analyse der Keimdichte von
BCG und der idnoKJ-Deletionsmutante (IW1)
in den Organen von SCID-Mäusen 77
4.4.2.1.1 Lunge 77
4.4.2.1.2 Leber 78
4.4.2.1.3 Niere 79
4.4.2.1.4 Milz 80
4.4.2.1.5 Gehirn 81
4.4.2.2 Pathologisch-anatomische Organbefunde 81
4.4.2.3. Pathologisch-histologische Organbefunde 82
4.4.2.3.1 Lunge 82
4.4.2.3.2 Leber 85
4.4.2.3.3 Niere 88
4.4.2.3.4 Gehirn 91
4.5 Vergleich einer ^norG-Mutante von BCG mit BCG+ in
immunkompetenten BALB/c-Mäusen 94
4.5.1 Quantitative Analyse der Keimdichte von BCG+
und der .dnarG-Deletionsinutante (IW1) in den Organen
von BALB/c-Mäusen 95
4.5.1.1 Lunge 95
4.5.1.2 Leber 96
4.5.1.3 Niere 97
4.5.1.4 Milz 98
4.5.1.5 Gebim 99
4.5.2 Pathologisch-anatomische Organbefunde 100
4.5.3 Pathologisch-histologischeOrganbefiinde 100
4.5.3.1 Lunge 100
4.5.3.2 Leber 102
4.5.3.3 Niere 104
4.5.3.4 Gehirn 106
4.6 Untersuchung auf Revertanten 107
5. Diskussion 10S
5.1 in vitro Experimente 108
5.2 in vivo Experimente 111
5.3 Ausblick 115
6. Zusammenfassung/Summa ry 117
7. Literaturverzeichnis 121
8. Anhang 147
8.1 Geräte 147
8.2 Chemikalien 147
8.3 Enzyme 148
8.4 Gebrauchsmaterialien 149
8.5 Rondaten 150
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