Charakterisierung und Identifizierung spezischer Phosphorylierungsstellen des humanen Grb2 Associated Binder-1-Proteins in vitro:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2001
|
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| Beschreibung: | Köln, Univ., Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
1.1
ENGLISCHE
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
1.2
DEUTSCHE
ZUSAMMENFASSUNG
.
2
2
EINLEITUNG
.
5
2.1
REZEPTOR-TYROSINKINASEN
(RTKS)
.
5
2.1.1
DER
INSULINREZEPTOR
(IR)
UND
INSULIN-IIKE
GROWTH
FACTOR-1
REZEPTOR
(IGF-1R)
.
6
2.2
DIE
INSULINREZEPTORSUBSTRAT
(IRS)-PROTELNFAMILIE
.
8
2.2.1
MITGLIEDER
DER
IRS-PROTEINFAMILIE
.
8
2.2.2
STRUKTUR
DER
IRS-PROTEINE
.
10
2.2.3
KOPPLUNGSMECHANISMEN
ZWISCHEN
IRS-PROTEINEN
UND
AKTIVIERTEN
REZEPTOREN.
12
2.2.3.1
PLECKSTRIN-HOMOLOGE
(PH)-DOMAENE
.
12
2.2.3.2
PHOSPHOTYROSIN-BINDENDE
(PTB)-DOMAENE
.
13
2.2.3.3
PHOSPHOTYROSINBINDENDE
DOMAENEN
IN
IRS-2
UND
GABI
.
13
2.2.4
SIGNALSPEZIFITAET
UND
GEWEBEVERTEILUNG
VERSCHIEDENER
IRS-PROTEINE
.
14
2.2.5
INTERAKTIONSPARTNER
DER
IRS-PROTEINE
.
14
2.2.6
DIE
ABSCHALTUNG
DER
IRS
VERMITTELTEN
SIGNALWEITERLEITUNG
.
16
2.2.7
DIE
ROLLE
DER
IRS-PROTEINE
IN
DER
INSULINRESISTENZ
.
17
2.3
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
.
20
3
ERGEBNISSE
.
21
3.1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
GAB-1
.
21
3.1.1
DAS
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
EXPRESSIONSSYSTEM
.
21
3.1.2
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
GAB-1
FUSIONSPROTEINS
.
22
3.2
FUNKTIONALE
ANALYSE
DER
RLR
UND
RLGF-1R-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
23
3.2.1
PHOSPHORYLIERUNG
REKOMBINANTER
GAB-1
PROTEINE
DURCH
RTKS
IN
VITRO
.
23
3.2.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
RLR-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
IN
GAB-1
.25
3.2.2.1
STRATEGIE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
VON
POSTTRANSLATIONALEN
MODIFIKATIONEN
WIE
PROTEINPHOSPHORYLIERUNGEN
.
25
3.2.2.2
ISOLIERUNG
TRYPTISCHER
GAB-1
PEPTIDE
ZUR
SEQUENZANALYSE
.
27
3.2.2.3
SEQUENZIERUNG
DER
TRYPTISCHEN
GAB-1
PEPTIDE
.
30
3.2.3
FUNKTIONALE
RELEVANZ
DER
RLR-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
37
3.2.3.1
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
VON
GAB-1
.
38
3.2.3.2
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
DER
PROTEINMUTANTEN
.
38
3.2.3.3
INTERAKTION
VON
GAB-1
MIT
PI-3-KINASE
.
39
3.3
FUNKTIONALE
ANALYSE
DER
MAPKINASEN-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
40
3.3.1
PHOSPHORYLIERUNG
REKOMBINANTER
GAB-1
PROTEINE
DURCH
MAPKINASEN
IN
VITRO.
41
3.3.2
KINETISCHE
ANALYSE
DER
ERK2-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
IN
GAB-1
.43
3.3.3
IDENTIFIZIERUNG
DER
ERK2-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
IN
GAB-1
.
47
3.3.3.1
ISOLIERUNG
TRYPTISCHER
GAB-1
PEPTIDE
ZUR
SEQUENZANALYSE
.
47
3.3.3.2
SEQUENZIERUNG
DER
TRYPTISCHEN
GAB-1
PEPTIDE
.
49
3.3.4
VERIFIZIERUNG
DER
ERGEBNISSE
VON
DER
PEPTIDSEQUENZIERUNG
MITTELS
MUTATIONSANALYSEN
.
57
3.3.4.1
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
VON
GAB-1
.
57
3.3.4.2
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
DER
PROTEINMUTANTEN
.
57
3.3.4.3
MUTATIONSANALYSE
MITTELS
ANIONENAUSTAUSCH
UND
REVERSED
PHASE
(RP)
CHROMATOGRAPHIE
.
58
3.3.4.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
AUS
DER
SEQUENZIERUNG
UND
DER
MUTATIONSANALYSE
.
63
3.3.4.5
FUNKTIONALE
RELEVANZ
DER
ERK2-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
65
4
DISKUSSION
.
69
4.1
EXPRESSION
VON
GAB-1
FUSIONSPROTEINEN
.
69
4.2
FUNKTIONALE
ANALYSE
DER
RLR
UND
RLGF-1R-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
70
4.2.1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
DURCH
DEN
RLR
UND
RLGF-1R
.
71
4.2.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
RLR-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
VON
GAB-1
.
72
4.2.3
FUNKTIONALE
RELEVANZ
DER
RLR-SPEZIFISCHEN
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
78
4.3
MAPKINASEN-SPEZIFISCHE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
80
4.3.1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
DURCH
ERK
UND
JNKINASEN
.
80
4.3.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
ERK2-SPEZIFISCHEN
SERIN-/
THREONIN
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
VON
GAB-1
.
81
4.3.3
VERIFIZIERUNG
DER
ERK2-SPEZIFISCHEN
SERIN-/
THREONIN
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
VON
GAB-1
.
85
4.3.4
FUNKTIONALE
ANALYSE
DER
MAPKINASEN-SPEZIFISCHEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
GAB-1
.
86
4.4
AUSBLICK
.
88
5
MATERIAL
UND
METHODEN
.
91
5.1
MATERIAL
.
91
5.1.1
NICHTBIOLOGISCHES
MATERIAL
.
91
5.1.2.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
95
5.2
METHODEN
.
98
5.2.1
ZELLKULTUR
.
98
5.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
98
5.2.2.1
OLIGONUKLEOTLD-SYNTHESE
.
98
5.2.2.2
KOMPETENTE
ZELLEN
.
99
5.2.2.3
PLASMIDPRAEPARATION
.
100
5.2.2.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
100
5.2.2.5
DNS-SEQUENZIERUNG
.
100
5.2.2.6
IN
VRFRO-MUTAGENESE
.
101
5.2.2.7
TRANSFORMATION
.
102
5.2.2.8
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREKONZENTRATIONEN
.
102
5.2.3
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
102
5.2.3.1
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
102
5.2.3.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
103
5.2.3.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
103
5.2.3.4
FAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
104
5.2.3.5
IN
WFRO-PHOSPHORYLIERUNG
.
104
5.2.3.6
PROTEOLYTISCHER
VERDAU
IM
GEL
UND
ELUTION
.
104
5.2.3.7
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
105
5.2.3.8
REVERSED-PHASE
CHROMATOGRAPHIE
.
105
5.2.3.9
PEPTIDSEQUENZIERUNG
.
106
5.2.3.10
MATRIX-ASSISTED-LASER-DESORPTION-IONIZATION
TIME
OF
FLIGHT
(MALDI-TOF)
MASSENSPEKTROMETRIE
.
106
5.2.3.11
GESAMT-PROTEINEXTRAKT-PRAEPARATION
.
107
5.2.3.12
GST-PULL
DOWN
ASSAY.
.
107
5.2.3.13
ELEKTROPHORETISCHER
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
POLYVINYLIDENDIFLUORID
(PVDF)-MEMBRAN
(WESTERN
BLOT)
.
107
5.2.3.14
CHEMILUMINESZENZDETEKTION
DER
SEKUNDAEREN
ANTIKOERPER
.
108
5.2.4
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
.
109
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
111
7
ANHANG
.
127
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
135 |
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| title_short | Charakterisierung und Identifizierung spezischer Phosphorylierungsstellen des humanen Grb2 Associated Binder-1-Proteins in vitro |
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| topic_facet | Insulinrezeptor Substrat Chemie Phosphorylierung Bindeproteine Hochschulschrift |
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