Pflanzenregeneration aus Protoplasten von Gerste (Hordeum vulgare L.) und genetische Transformation des homologen seneszenzassoziierten Gens HvS40:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2001
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| adam_text | Titel: Pflanzenregeneration aus Protoplasten von Gerste (Hordeum vulgare L.) und genetische Transformation
Autor: Stöldt, Annette
Jahr: 2001
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen
1. EINLEITUNG.........................................................................................................1
1.1 Produktion und Verwendung von Gerste..................................................................1
1.2 Gerstein der Pflanzenzüchtung.................................................................................1
1.3 In v//ro-Kultursysteme bei Gerste.............................................................................2
1.4 Protoplastenkultur bei Gerste....................................................................................2
1.5 Gentechnologische Methoden in der Pflanzenzüchtung...........................................5
1.6 Molekulare Grundlagen der Blattseneszenz..............................................................6
1.7 Zielsetzung dieser Arbeit.........................................................................................12
2. MATERIAL UND METHODEN.........................................................................13
2.1 Chemikalien und allgemeines Verbrauchsmaterial.................................................!3
2.2 Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen............................................................13
2.3 Pflanzenmedien.......................................................................................................14
2.4 Zeilbiologische Arbeitsmethoden............................................................................16
2.4.1 Isolierung und Kultur von Scutella.........................................................................16
2.4.2 Isolierung und Kultur von Mikrosporen..................................................................! 6
2.4.3 Isolierung und Kultur von Antheren.......................................................................17
2.4.4 Suspensionskultur....................................................................................................17
2.4.5 Protoplasten.............................................................................................................17
2.4.5.1 Isolierung und Reinigung der Protoplasten.............................................................17
2.4.5.2 Protoplastenkultur...................................................................................................18
2.4.5.3 Kalluskultur und Sprossregeneration......................................................................18
2.4.6 Durchflußcytometrtsche DNA-Gehaitsbestimmung...............................................19
2.5 Transformationsmethoden.......................................................................................19
2.5.1 Protopiastentransformation.....................................................................................19
2.5.2 Bioiistische Transformation....................................................................................19
2.6 Statistische Auswertung..........................................................................................20
2.7 Molekularbiologische Methoden.............................................................................20
2.7.1 Plasmide..................................................................................................................20
2.7.2 Oligonukleotide zur Sondenherstellung..................................................................21
2.7.3 Digoxygenin-Markierung von DNA-Fragmenten...................................................21
2.7.4 Radioaktive Markierung..........................................................................................21
2.7.5 Isolierung genomischer DNA aus Gerste................................................................22
2.7.6 Induktion des SAG HvS40......................................................................................22
2.7.7 Isolierung von Gesamt-RNA...................................................................................22
Inhaltsverzeichnis
2.8 Nachweis transienter GÜS-Aktivität in Protoplasten..............................................22
2.8.1 Histochemischer Test..............................................................................................22
2.8.2 ß-Glucuronidase-Aktivitätstest................................................................................22
2.9 Analyse transgener Pflanzen...................................................................................23
2.9.1 BASTA-S-Sprühtest................................................................................................23
2.9.2 Southem-Blot-Analyse............................................................................................23
2.9.3 Northern-Blot-Analvse............................................................................................23
3. ERGEBNISSE.......................................................................................................25
3.1 Etablierung eines Protoplastenregenerationssystems für Gerste.............................25
3.1.1 Einfiuss der Vorkultur auf die Protoplastenausbeute und -entwicklung................25
.2 Einfiuss des Geliermittels auf die Protoplastenentwicklung...................................27
.3 Einfiuss des Populationsdichte auf die Protoplastenentwicklung...........................29
.4 Einfiuss der Feeder auf die Protoplastenentwicklung.............................................29
.5 Pftanzenregeneration...............................................................................................33
.6 Charakterisierung der Regenerate...........................................................................36
3.2 Transformation mit einem Markergen.....................................................................37
3.2.1 Transiente Expression von Markergenen in
Gerstenprotoplasten aus primärem Kallus..............................................................37
3.2.2 Stabile Transformation von Gerstenmikrosporen und -scutella
mit einem Selektionsmarker....................................................................................39
3.3 Stabile Transformation von Gerstenmikrosporen und -scutella
mit dem Seneszenz-assoziierten Gen (SAG) HvS40...............................................42
3.3.1 Untersuchungen zur Integration des SAG in To-Gerstenpflanzen..........................42
3.3.2 Phänotyp der transgenen T0-Gerstenpflanzen und ihrer Nachkommen..................45
3.3.3 Vererbung der Transgene in der TrGeneration......................................................47
3.3.4 Expression des Transgens in den Nachkommen.....................................................49
4. DISKUSSION........................................................................................................53
4.1 Etabiierung eines Protoplastenregenerationssystems aus primärem Kallus............53
4.2 Experimente zur transienten Expression von Markergenen in Protoplasten...........65
4.3 Biolistische Transformation von Mikrosporen und Scutella
mit einem Markergen.............................................................................................67
4.4 Transformation mit dem Seneszenz-assoziierten Gen HvS40................................71
4.5 Die Expression der Sense- und Antisense-iConstrukte
in den transgenen Pflanzen......................................................................................73
4.6 Schlussfolgerung und Ausblick...............................................................................74
5. ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................77
6. LITERATURVERZEICHNIS.............................................................................79
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