Analyse nukleo-zytoplasmatischer Transportvorgänge der Regulatorproteine pUL84 und pUL69 des humanen Cytomegalovirus:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
ZUSAMMENFASSUNG
.
6
B.
EINLEITUNG
.
7
C.
FRAGESTELLUNG
.
15
D.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
16
1.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
16
1.1.
BAKTERIEN
.
16
1.2.
HEFE
.
16
1.3.
EUKARYOTE
ZELLEN
.
16
1.4.
VIRUSSTAEMME
.
16
1.5.
SEREN,
ANTIKOERPER
UND
PEPTIDE
.
16
1.5.1.
SEREN
.
16
1.5.2.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.
17
1.5.3.
SEKUNDAERANTIKOERPER
.
17
1.5.4.
PEPTIDE
.
17
2.
NUKLEINSAEUREN
.
18
2.1.
OLIGONUKLEOTIDE
.
18
2.1.1.
DOPPELSTRAENGIGE
OLIGONUKLEOTIDE
.
18
2.1.2.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
IN
VITRO-MUTAGENESEN
.
18
2.1.3.
PRIMER
FUER
PCR-KLONIERUNGEN
.
19
2.2.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
20
2.2.1.
VEKTOREN
UND
VEKTORSYSTEME
.
20
2.2.2.
ZUR
VERFUEGUNG
GESTELLTE
PLASMIDE
.
20
2.2.2
1.
PUL84
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
20
2.2.22.
PUL69-EXPRESSIONSPLASMIDE
.
21
2.2.2.3.
SONSTIGE
PLASMIDE
.
21
2.2.3.
NEU
KONSTRUIERTE
PLASMIDE
.
22
2.2.3.1
.
PUL84-EXPRESSIONSPLASMIDE
.
22
2.2.3.2.
PL)L69-EXPRESSIONSPLASMIDE
.
23
2.2.3.3.
IMPORTIN
A-EXPRESSIONSPLASMIDE
.
23
2.2.3.4.
SONSTIGE
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
23
2.3.
CDNA-GENBANKEN
.
23
2.4.
SONSTIGE
NUKLEINSAEUREN
.
24
3.
ENZYME,
MEDIEN
UND
FEINCHEMIKALIEN
.
24
3.1.
ENZYME
.
24
3.2.
MEDIEN
.
24
3.3.
STANDARD-PUFFERLOESUNGEN
.
25
3.4.
FEINCHEMIKALIEN
.
25
4.
STANDARDMETHODEN
UND
REAGENZSYSTEME
.
25
5.
DNA-METHODEN
.
26
5.1.
PCR-REAKTIONEN
/
DELETIONSMUTAGENESE
.
26
5.2.
ALANIN-AUSTAUSCHMUTAGENESE
.
26
6.
ZELLKULTUR,
INFEKTIONSEXPERIMENTE
UND
ZELLBIOLOGISCHE
VERFAHREN
.
27
6.1.
ZELLKULTUR
.
27
6.2.
INFEKTION
.
27
6.3.
TRANSFEKTIONEN
.
27
6.4.
LUZIFERASE-ANALYSEN
.
28
6.5.
INHIBITION
DES
KERNIMPORTS
DURCH
ACTINOMYCIN
D
.
28
6.6.
HETEROKARYON-ANALYSEN
.
28
6.7.
IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSEN
.
29
6.8.
IN
VITRO
KEMIMPORTANALYSEN
IN
DIGITONIN
PERMEABILISIERTEN
ZELLEN
.
29
6.9.
MIKROINJEKTION
.
30
7.
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
PROTEINEN
UND
PROTEININTERAKTIONEN
.
30
7.1.
REINIGUNG
VON
GST-FUSIONSPROTEMEN
AUS
E.
COLI
.
30
7.2.
GELELEKTROPHORESE
UND
FAERBUNG
.
31
7.3.
GST-AFFINITAETSPRAEZIPITATIONEN
.
31
7.4.
IMMUNOBLOT
.
32
7.5.
KOIMMUNOPRAEZIPITATION
.
32
8.
INTERAKTIONSKLONIERUNG
IN
HEFE
(YEAST-TWO-HYBRID)
.
33
8.1.
TRANSFORMATION
.
33
8.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
INTERAKTIONSKLONIERUNG
.
33
8.3.
FILTER-TEST
.
34
8.4.
ONPG-TEST
.
34
8.5.
ISOLATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
HEFE
.
34
8.6.
HERSTELLUNG
GESAMTZELLULAERER
HEFELYSATE
.
35
E.
ERGEBNISSE
.
36
1.
AUFKLAERUNG
DES
KERNIMPORTMECHANISMUS
DES
HCMV
UL84-PROTEINS
.
36
1.1.
DAS
UL84-PROTEIN
INTERAGIERT
SPEZIFISCH
MIT
KOMPONENTEN
EINES
ZELLULAEREN
KERN-IMPORTSYSTEMS
.
36
1.1.1.
IDENTIFIZIERUNG
VON
IMPORTIN
A1,
A3,
A4
UND
A5
ALS
ZELLULAERE
BINDUNGS
PARTNER
VON
PUL84
DURCH
HEFE-INTERAKTIONSKLONIERUNG
.
36
1.1.2.
BESTAETIGUNG
DER
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
PUL84
UND
IMPORTIN
A-PROTEINEN
DURCH
GST-AFFINITAETSPRAEZIPITATION
.
40
1.1.3.
BESTAETIGUNG
DER
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
PUL84
UND
IMPORTIN
A-PROTEINEN
DURCH
KOIMMUNOPRAEZIPITATION
.
41
1.2.
DIE
IMPORTIN
A-LNTERAKTIONSDOMAENE
DES
UL84-PROTEINS
ENTSPRICHT
FUNKTIONELL
EINEM
NEUARTIGEN
NUKLEAEREN
LOKALISATIONSSIGNAL
(NLS)
.
42
1.2.1.
EINGRENZUNG
EINER
IMPORTIN
A-LNTERAKTIONSDOMAENE
INNERHALB
VON
PUL84
.
.42
1.2.2.
BESTAETIGUNG
DER
NUKLEAEREN
LOKALISATION
VON
PUL84
NACH
INFEKTION
UND
TRANSFEKTION
.
44
1.2.3.
EINGRENZUNG
EINES
NICHT-KONVENTIONELLEN
NLS
IN
PUL84
.
45
1,3.
DIE
INTERAKTION
ZWISCHEN
PUL84
UND
IMPORTIN
A
IST
FUER
DEN
KERNIMPORT
VON
PUL84
ESSENZIELL
.
47
1.3.1.
KOMPETITIVE
IN
V/FRO-LMPORTANALYSEN
ZEIGEN
EINE
ABHAENGIGKEIT
DES
PUL84-KERNIMPORTS
VON
IMPORTIN
A-PROTEINEN
.
47
1.3.2.
IDENTIFIKATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
PUL84
KERN-IMPORTWEGS
DURCH
IN
V/FRO-LMPORTANALYSEN
.
49
2.
IDENTIFIZIERUNG
VON
PUL84
UND
PUL69
ALS
NEUE
VIRALE
NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHE
YYSHUTTLING
"
-PROTEINE
.
50
2.1.
DAS
UL84-PROTEIN
BESITZT
EIN
KLASSISCHES
NES
UND
WANDERT
IN
INFIZIERTEN
UND
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
ZWISCHEN
ZELLKERN
UND
ZYTOPLASMA
.
50
2.1.1.
IDENTIFIZIERUNG
EINES
FUNKTIONELLEN,
KLASSISCHEN
NES
IN
P(JL84
.
50
2.1.2.
NACHWEIS
DES
NUKLEAEREN
EXPORTS
VON
PUL84
IN
INFIZIERTEN
UND
TRANS
FIZIERTEN
ZELLEN
.
53
2.1.3.
ABHAENGIGKEIT
DER
NUKLEAEREN
LOKALISATION
DES
UL84
PROTEINS
VON
FORT
SCHREITENDER
T
RANSLATION
.
55
2.2.
DAS
UL69-PROTEIN
WANDERT
IN
INFIZIERTEN
UND
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
ZWISCHEN
ZELLKERN
UND
ZYTOPLASMA
UND
WIRD
UEBER
EINEN
VON
CRM1
UNABHAENGIGEN
TRANS
PORTWEG
AUS
DEM
ZELLKERN
EXPORTIERT
.
56
2.2.1.
NACHWEIS
EINES
NUKLEO-ZYTOPLASMATISCHEN
YYSHUTTLING
"
VON
PUL69
IN
INFIZIERTEN
UND
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.
56
2.2.2.
ABGRENZUNG
DES
PUL69-KERNEXPORTS
VOM
CRM1-VERMITTELTEN
TRANSPORT
.
58
3.
CHARAKTERISIERUNG
EINES
NEUARTIGEN
KERN-EXPORTSIGNALS
(NES)
INNERHALB
VON
PUL69.59
3.1.
DER
NUKLEAERE
EXPORT
VON
PUL69
WIRD
UEBER
EIN
NEUARTIGES
NES
VERMITTELT
.
59
3.1.1.
EINGRENZUNG
EINER
NES-DOMAENE
INNERHALB
DES
PUL69
.
59
3.1.2.
VERMITTLUNG
DES
KERNEXPORTS
HETEROLOGER
PROTEINE
DURCH
DAS
PUL69-NES.61
3.1.3.
CRM1-UNABHAENGIGER
NUKLEAERER
EXPORT
DURCH
DAS
ISOLIERTE
PUL69-NES
.
63
3.1.4.
EINGRENZUNG
EINER
MINIMALDOMAENE
DES
P(JL69-NES
.
64
3.2.
DAS
PUL69-NES
IST
EIN
BISHER
EINZIGARTIGES
EXPORTSIGNAL
UND
IST
FUNKTIONELL
FUER
DIE
PUL69-VERMITTELTE
TRANSAKTIVIERUNG
ESSENZIELL
.
65
3.2.1.
ABGRENZUNG
DES
PUL69-NES
VON
BEKANNTEN
EXPORTSIGNALEN
.
65
3.2.2.
NACHWEIS
EINER
KORRELATION
ZWISCHEN
P(JL69
YYSHUTTLING
"
UND
P(JL69
VERMITTELTER
TRANSAKTIVIERUNG
.
66
F.
DISKUSSION
.
68
G.
LITERATURVERZEICHNIS
.
78
H.
ABKUERZUNGEN
.
89 |
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