Effektorfunktionen von intestinalen intraepithelialen Lymphozyten:
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Aachen
Shaker
2002
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|---|---|
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Seite
1. Einleitung 1
1.1. Intestinale intraepitheliale Lymphozyten 1
1.1.1. Intestinales Immunsystem 1
1.1.2. Intraepitheliale Lymphozyten 2
1.1.3. Phänotyp der IEL 4
1.2. Effektorfunktionen der IEL 5
1.2.1. Proliferationsverhalten der IEL 5
1.2.2. MHC Restriktion der IEL und Antigenerkennung 6
1.2.3. Zytotoxische Mechanismen 7
1.2.4. Zytotoxizität der IEL 9
1.3. Fragestellung 11
2. Material und Methoden 12
2.1. Materialien 12
2.1.1. Tiere 12
2.1.2. Zellinien 12
2.1.3. Lösungen 12
2.1.4. Materialliste 15
2.2. Zellisolierung 17
2.2.1. Isolierung von murinen intestinalen IEL 17
2.2.2. Separation von IEL Subpopulationen mittels 18
magnetischer Zellsortierung
2.2.3. Isolierung von murinen Splenozyten 19
2.3. Zellkultur 19
2.3.1. /n wfro Kulturbedingungen 19
2.3.2. Vitalitäts und Zellzahlbestimmung 20
2.4. Zellcharakterisierung 20
2.4.1. Zellfärbung mit Antikörpern 20
2.4.2. Durchflusszytometrische Phänotypanalyse 21
2.5. Bestimmung der Zytotoxizität 22
2.5.1. Spontane Zytotoxizität 22
2.5.2. Stimulierte Zytotoxizität 23
2.5.3. Vorbehandlung von Zielzellen 23
2.5.4. Stressbehandlung von Zielzellen 23
2.6. Zytotoxizitätsmessverfahren 24
2.6.1. Chrom Release Test 24
2.6.2. Zelluläre DNA Fragmentations Verfahren 25
2.7. ELISA und colorimetrische Verfahren 25
2.7.1. ZytokinELISA 25
2.7.2. DNA Fragmentations ELISA 26
2.7.3. Serinesterase Assay 27
2.8. Molekularbiologische Methoden 27
2.8.1. RNA Isolierung 27
2.8.2. Reverse Transkription 28
2.8.3. PCR 28
2.8.4. Western Blotting 29
2.9. Abkürzungen 30
3. Ergebnisse 32
3.1. Phänotyp der EL 32
3.1.1. Charakterisierung der isolierten IEL 32
3.1.2. RT PCR für FasL 34
3.1.3. FasL und Fas Expression auf IEL 35
3.1.4. Verteilung von FasL auf y5+ IEL 37
3.1.5. FasL Expression auf IEL nach Stimulation 38
3.1.6. CD95 Expression von Zielzellen 39
3.2. Unspezifische Zytotoxizität 42
3.2.1. Messung der spontanen und stimulierten Zytotoxizität
von IEL 42
3.2.2. Con A stimulierte Zytotoxizität von IEL gegen CD95
positive Zielzellen 45
3.2.3. Con A stimulierte Zytotoxizität von IEL gegen vorbe¬
handelte Zielzellen 47
3.3. Zytotoxische Mechanismen der IEL 50
3.3.1. Hemmung der Con A induzierten Zytotoxizität von IEL
durch Fas Antikörper 50
3.3.2. Aktivierung der Zytotoxizität der IEL durch Stimulation des
T Zell Rezeptors 54
3.3.3. Ca2+ Abhängigikeit der Con A stimulierten Zytotoxizität
vonIEL 55
3.3.4. Sekretorische Zytotoxizitätsmechanismen der IEL 57
3.3.5. Zytokinproduktion von IEL 59
3.4. Spezifische Zytotoxizität 60
3.4.1. Spontane Zytotoxizität von IEL gegen Zielzellen nach Hitze ,
oxidativer und metabolischer Stressbehandlunggestresste 60
3.4.2. Lyse von Hitze gestressten L1210 und L1210 Fas Zellen
durch IEL 63
3.4.3. Zytotoxizität gegen 24 h zuvor gestresste Zielzellen 64
3.4.4. HSP70 Produktion von gestressten Zielzellen 64
3.4.5. Lyse von HSP70 gepulsten Zielzellen 65
3.4.6. Fas Expression von gestressten Zellen 67
3.4.7.
4. Diskussion 68
4.1. Phänotyp der IEL 68
4.2. Mechanismen der Zytotoxizität der IEL und die
funktionelle Rolle von FasLigand 69
4.3. Spezifische Zytotoxizität der IEL und die Bedeutung von
HSP 70 als mögliches Zielantigen für die IEL 77
4.4. Klinische Bedeutung der IEL und ihrer FasL Expression 81
5. Zusammenfassung 85
6. Literaturverzeichnis 88
7. Anhang 100
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