Molekulare und epidemiologische Charakterisierung von Resistenz-assoziierten Mutationen bei Mycobacterium tuberculosis:
Gespeichert in:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch-und-Buch-Verl.
2002
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| Beschreibung: | Zugl.: München, Univ., Med. Fak., Diss., 2002 |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis:
1 Einleitung 1
1.1 Aspekte der Tuberkulose 1
1.1.1 Geschichte der Tuberkulose 1
1.1.2 Überblick über die heutige Situation 2
1.1.3 Entwicklung von Resistenzen 3
1.1.4 Taxonomie der Mykobakterien 6
1.1.5 Pathogenese und Klinik 7
1.1.6 Diagnose 9
1.1.7 Therapie 11
1.2 Wichtige Resistenzgene bei Mycobacterium tuberculosis 12
1.3 Das Phänomen der Heteroresistenz 15
2 Problemstellung und Zielsetzung 17
3 Material und Methoden 19
3.1 Material 19
3.1.1 Geräte 19
3.1.2 Chemikalien 20
3.1.3 Gelmaterialien 21
3.1.4 Enzyme 21
3.1.5 Nukleotide 22
3.1.6 Kommerzielle „Kits 23
3.1.7 Filme 23
3.1.8 Sonstiges 23
3.2 Verwendete Sputen und Kulturen 24
3.3 Methoden 28
3.3.1 Isolierung von Mykobakterien DNA aus Sputum 28
3.3.2 Isolierung von Mykokaterien DNA aus Kultur (Dobner, 1997c) 29
3.3.3 DNA Amplifizierung durch Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988) 29
3.3.4 Ligation 32
3.3.5 Herstellung elektrokompetenter Zellen 32
3.3.6 Elektroporation und Selektion rekombinanter Klone 33
3.3.7 Reinigung von DNA 34
3.3.7.1 Plasmidpräparation, reinigung und analyse 34
3.3.7.2 Reinigung von DNA durch Silikamembran Adsorption 35
3.3.7.3 Reinigung des Plasmids pBluescript II SK ( ) 37
3.3.7.4 Reinigung von DNA mit einer Größe von mehr als 300 Basenpaaren 38
3.3.7.5 Reinigung von DNA mit einer Größe von weniger als 300 Basenpaaren .... 39
3.3.8 Restriktionsfragmentlängen Polymorphismus (RFLP) 40
3.3.8.1 RFLP der PCR Produkte des katG Gens (Isoniazidresistenzschnelltest) .... 40
3.3.8.2 RFLP der PCR Produkte des rpsL Gens (Streptomycinresistenzschnelltest) . 40
3.3.8.3 RFLP der PCR Produkte des embB Gens (Ethambutolresistenzschnelltest) . 41
3.3.8.4 Restriktion von PCR Amplifikaten zur Klonierung 42
3.3.8.5 Restriktion zur Untersuchung rekombinanter Klone 45
3.3.8.6 Restriktion des Vektors pBluescript II SK ( ) für die Ligation 47
3.3.9 Agarosegelelektrophorese 48
3.3.10 DNA Sequenzierung 49
3.3.10.1 Sequenzierung der klonierten rekombinanten Plasmide 49
3.3.10.2 Direkte Sequenzierung der gereinigten PCR Produkte 50
3.3.10.3 Sequenzgel 50
4 Ergebnisse 53
4.1 Methodenvergleich zur DNA Aufarbeitung 53
4.2 Optimierung der PCR Parameter zur Amplifizierung der Gene embB und rpsL 53
4.2.1 Voroptimierung der Annealingtemperatur 54
4.2.2 Optimierung der Magnesiumionenkonzentration 55
4.2.3 Einfluß von DMSO 56
4.2.4 Optimierung der Annealingtemperatur 57
4.2.5 Zyklenzahloptimierung bei nested PCR 59
4.2.6 Zusammenfassung der PCR Optimierungsergebnisse 61
4.3 Kulturunabhängige Charakterisierung von Resistenzgen Mutationen
direkt aus klinischem Material 61
4.3.1 Vorhersage der Ethambutolresistenz 61
4.3.2 Vorhersage der Streptomycinresistenz 65
4.4 Prävalenz von Resistenzmutationen in Antituberkulotika resistenten
M. tuberculosis so aten 69
4.4.1 Mutationen des Gens pncA (Pyrazinamidresistenz) 69
4.4.2 Mutationen des Gens gyrA (Fluorochinolonresistenz) 72
4.4.3 Mutationen des Gens embB (Ethambutolresistenz) 73
4.5 Mischpopulationen resistenter und sensibler M. tuberculosis in Sputum 74
4.5.1 emM? Mischpopulationen 75
4.5.2 r/wi Mischpopulationen 76
4.5.3 /taG Mischpopulationen 78
5 Diskussion 80
5.1 Methodische Aspekte 80
5.1.1 Polymerasekettenreaktion 80
5.1.2 Primerkonstuktion 81
5.1.3 Sequenzierung 86
5.2 Molekulare Schnelltests zur Resistenzvorhersage 87
5.2.1 Ethambutolresistenzvorhersage 88
5.2.2 Streptomycinresistenzvorhersage 90
5.3 Prävalenzuntersuchungen von Resistenzgenmutationen 92
5.3.1 Mutationen des Gens pncA (Pyrazinamidresistenz) 93
5.3.2 Mutationen des Gens gyrA (Fluorochinolonresistenz) 95
5.3.3 Mutationen des Gens embB (Ethambutolresistenz) 97
5.4 Heteroresistenz 98
6 Zusammmenfassung 101
7 Literaturverzeichnis 103
8 Abkürzungen 114
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