Strukturuntersuchungen an Porinen aus Pro- und Eukaryonten:
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2000
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Beschreibung: | München, Techn. Univ., Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY.1
1 EINLEITUNG.3
1.1 ALLGEMEINE EINFUEHRUNG . . 3
1.1.1 PROTEINE DER AEUSSEREN MEMBRAN . 6
YY STRUKTURPRINZIPIEN
. 6
YY STRUKTURKLASSEN DER AEUSSEREN MEMBRAN 7
1.2 SPEZIELLE EINFUEHRUNG
. 9
1.2.1 PORINE DER AM GRAM-NEGATIVER BAKTERIEN 9
YY UNSPEZIFISCHE PORINE . - . 10
YY SPEZIFISCHE PORINE 10
1.2.2 PORINE IN PATHOGENEN BAKTERIEN . 11
1.2.3 PORINE IN MITOCHONDRIEN
. 11
1.2.4 PORINE IN CHLOROPLASTEN .12
1.2.5 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON PORINEN 13
YY LEITFAEHIGKEITSMESSUNGEN 13
YY DER LIPOSOMEN-SCHWELLUNGSASSAY . 16
1.3 ZIEL DER ARBEIT UND MOTIVATION 16
2 MATERIAL UND METHODEN.17
2.1 MATERIAL UND METHODEN ZU OMP32 UND DEM 54-AS-PEPTID 17
2.1.1 ISOLIERUNG UND REINIGUNG DES PORIN-PEPTID-KOMPLEX . 17
2.1.2 REINIGUNG UND SEQUENZIERUNG DES 54-AS PEPTIDS 18
2.1.3 CHEMISCHE MODIFIKATION VON OMP32 DURCH OEUCCINYLIERUNG 19
2.1.4 BROMCYAN-UND TRYPSINABBAU 19
2.1.5 FTIR-SPEKTROSKOPIE
. 20
2.1.6 ANALYSE DER PROBEN UEBER MALDI-MS . 21
2.1.7 ANALYSE DER PROTEINPROBEN UEBER ESL-MS 22
2.1.8 3D-KRISTALLISATION VON OMP32 UND
S100
22
2.1.9 KRISTALLMONTAGE UND DATENAUSWERTUNG . 23
2.1.10 DERIVATANALYSE UND PHASIERUNG UEBER SIRAS 25
2.1.11 STRUKTURLOESUNG UEBER DEN MOLEKULAREN ERSATZ 25
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.1.12 MOLEKUELBAU UND VERFEINERUNG DER KOORDINATEN 26
2.2 MATERIAL UND METHODEN ZU HVDAC1 UND HVDAC2 27
2.2.1 EXPRESSION, REINIGUNG UND RUECKFALTUNG 27
2.2.2 BINDUNG VON HVDAC1 AN ATP-AGAROSE 29
2.2.3 DYNAMISCHE LICHTSTREUUNG AN HVDAC1 29
2.2.4 FTIR-ATR AN RUECKGEFALTETEN VDAC-PROBEN 29
2.2.5 ELEKTRONENMIKROSKOPIE
. 30
2.2.6 3D-KRISTALLISATION
. 31
2.3 MATERIAL UND METHODEN ZU P100
. 31
2.3.1 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON P100 . 31
2.3.2 FTIR-SPEKTROSKOPIE AN P100
. 32
2.3.3 2D-KRISTALLISATION VON P100 . . 32
2.3.4 ELEKTRONENMIKROSKOPIE
. 33
2.3.5 AFM-UNTERSUCHUNGEN AN P100
. 33
2.4
PUFFER. . 34
2.5
ABKUERZUNGEN . 35
3 ERGEBNISSE.36
3.1 ALLGEMEINES
. 36
3.1A ALLGEMEINES ZU
COMAMONAS ACIDOVORANS . 36
3.1B ALLGEMEINES ZUR FUNKTION VON OMP32 . 37
3.1.1A SEQUENZVERGLEICH ZUR PORIN-UEBERFAMILIE 38
3.1.1BISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG 54-AS-PEPTIDS 41
3.1.2 REINIGUNG VON OMP32 AUS C.
ACIDOVORANS 42
3.1.3 CHEMISCHE MODIFIKATION UND DEREN ANALYSE 44
3.1.4 3D-KRISTALLISATION UND ROENTGENKRISTALLOGRAFIE/ . 50
3.1.5 MOLEKULARER ERSATZ UND SUCHE NACH SCHWERATOMDERIVATEN 53
3.1.6 MODELLBAU UND STRUKTURVERFEINERUNG . 54
3.1.7 KRISTALLPACKUNG UND STRUKTURBESCHREIBUNG 55
3.1.8 STRUKTURBESCHREIBUNG DES PEPTID-KOMPLEXES . 57
3.1.9 DIE PORINSTRUKTUR
. 59
3.1.10 DIE AROMATEN-UND LYSINGUERTEL
. 61
3.1.11 ELEKTROSTATISCHE EIGENSCHAFTEN DER PORE 63
3.1.12 DIE PORE: UEBERLEGUNGEN ZUR STRUKTUR UND FUNKTION 63
UE
3.2 ERGEBNISSE ZU VDAC
. 66
3.2.1 SEQUENZANALYSE
. 66
3.2.2 SEKUNDAERSTRUKTURVORHERSAGE
. 67
3.2.3 EXPRESSION VON HVDAC1 UND HVDAC2 68
3.2.4 ATP-BINDUNG, DLS UND FTIR SPEKTROSKOPIE 71
3.2.5 ELEKTRONENMIKROSKOPIE AN HVDAC1 . 73
3.2.6
PEPTIDE MAPPING UND DIE TOPOLOGIE VON HVDAC1 76
3.3 ERGEBNISSE ZU PORIN P100 AUS
THERMITS THERMOPHILUS 79
3.3.1 HOMOLOGIEUEBERLEGUNGEN UND SEKUNDAERSTRUKTURVORHERSAGEN 79
3.3.2 ZELLZUCHT UND REINIGUNG
. 82
3.3.3 FTIR SPEKTROSKOPIE.
. 83
3.3.4 2D-KRISTALLISATION UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 84
3.3.5 AFM-UNTERSUCHUNGEN AN 2D-KRISTALLEN VON P100 86
DISKUSSION 92
4.1 DISKUSSION ZU OMP32 . 92
4.1.1 SEQUENZANALYSE VON OMP32 UND VERWANDTEN PORINEN 92
4.1.2 TOPOLOGIEUNTERSUCHUNGEN AN OMP32 .
94
4.1.3 KRISTALLISATION UND DATENSAMMLUNG . 95
4.1.4
MOLECULAR REPLACEMENT UND SIR-STRUKTURLOESUNG 95
4.1.5 STRUKTURANALYSE UND VERGLEICH MIT BEKANNTEN PORINEN 96
YY ARCHITEKTUR DES PORIN-PEPTID-KOMPLEXES 96
YY FALTUNGSSTRUKTUR DES PORINS . 98
YY DER TRIMERKONTAKTBEREICH 100
YY DER HYDROPHOBE MEMBRAN-EXPONIERTE BEREICH 101
YY DER HYDROPHILE MEMBRANBEREICH YY' . 102
YY DAS POLARE PORENINNERE 102
YY DIE CA
2+-BINDUNGSSTELLE 104
YY
MOLECULAR MODE HING VON PORINEN 106
4.2 DISKUSSION ZU VDAC I09
4.2.1 SEQUENZANALYSE VON HVDAC1 UND HVDAC2 109
4.2.2 EXPRESSION UND RUECKFALTUNG 109
4.2.3 OLIGOMERISATION UND SEKUNDAERSTRUKTURANALYSE
112
4.2.4 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSE VON HVDAC1 114
4.2.5
PEPTIDE-MAPPING-ANALYSE 116
4.3 DISKUSSION ZU P100 118
4.3.1 HOMOLOGIEBETRACHTUNGEN . 118
4.3.2 SEKUNDAERSTRUKTURANALYSE . 119
4.3.3 2D-KRISTALLISATION UND ULTRASTRUKTURANALYSE 120
4.3.4 2D-KRISTALLE UND RASTERKRAFT-MIKROSKOPIE 121
5 LITERATUR 122
IV |
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