Diagnostik verschiedener DNA- und RNA-Viren mittels nested PCR und nested RT-PCR aus der Myokardbiopsie von Patienten mit Verdacht auf Myokarditis und Dilatative Kardiomyopathie:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. DIE VIRALE MYOKARDITIS 2
1.1.1. KARDIOTROPE VIREN 2
1-1.2. KLINIK UND DIAGNOSTIK DER MYOKARDITIS 3
1.2. DILATATIVE KARDIOMYOPATHIE 4
1.3. ENDOMYOKARDBIOPSIEN-DIAGNOSTISEHE MOEGLICHKEITEN UND GRENZEN 5
1.3.1. HISTOLOGIE 5
1.3.2. IMMUNHISTOCHEMIE 6
1.3.3. KLASSISCHE VIRUSDIAGNOSTIK 7
1.3.4. MOLEKULARBIOLOGISCHE MOEGLICHKEITEN ZUM VIRUSNACHWEIS 8
2. ZIELSTELLUNG 10
3. MATERIAL UND METHODEN 11
3.1. PATIENTEN- UND KONTROLLGRUPPE 11
3.1.1. PATIENTEN 11
3.1.2. KONTROLLGRUPPE 11
3.2. RNA-ISOLIERUNG 11
3.3 VERDAUUNGSREAKTION MIT DNASE 12
3.4. TRANSKRIPTION IN C-DNA 13
3.5. DNA-ISOLIERUNG 13
3.6. FOTOMETRISCHE MESSUNG / 14
3.7. PCR 15
3.7.1. REAKTIONSABLAUF UND REAKTIONSBEDINGUNGEN DER PCR 15
3.7.2. NESTED PCR 16
3.7.3. PRIMERDESIGN 16
3.7.4. GAPDH-NACHWEIS 17
3.7.5. ENTENYVIREN 18
3.7.6. ADENOVIREN 19
3.7.7. CYTOMEGALIEVIREN 19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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N
3.7.8. EPSTEIN-BARR-VIREN 20
3.8. POSITIVKONTROLLEN 21
3.9. AGAROSEGELELEKTROPHORESE UND GELAUSWERTUNG 21
3.10. SEQUENZIERUNG 21
3.10.1. AUFREINIGUNG DER PCR-AMPLIFIKATE 22
3.10.2. SEQUENZIERUNGSREAKTION 23
3.10.3. PROBENAUFBEREITUNG 23
3.10.4. AUSWERTUNG DER SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE 23
3.11. MATERIAL UND GERAETE 24
3.11.1 CHEMIKALIEN 24
3.11.2. GERAETE 25
4. ERGEBNISSE ~ 26
4.1. UNTERSUCHUNGEN ZUR SENSITIVITAET DER PCR 26
4.1.1. ENTEROVIREN 26
4.1.2. DNA-VIREN 27
4.2. KONTROLLGRUPPE 29
4.2.1. ALLGEMEINE ANGABEN 29
4.2.2. PCR-ERGEBNISSE 30
4.3. PATIENTEN MIT DILATATIVER KARDIOMYOPATHIE UND MYOKARDITIS 30
4.3.1. ALLGEMEINE ANGABEN 30
4.3.2. HISTOLOGISCHE DIAGNOSEN 31
4.3.3. AUSWERTUNG DER PCR-VIRUSDIAGNOSTIK 32
4.3.3.1. ENTEROVIREN 32
4.3.3.2. DNA-VIREN / 34
4.3.3.3 UEBERBLICK UEBER ALLE VIRUSPOSITIVEN PROBEN 36
4.3.4. VIRUSNACHWEIS IN BEZUG AUF IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 37
4.3.5. ERGEBNISSE DER SEQUENZIERUNG 39
M
5. DISKUSSION 41
5.1. KRITIK DER METHODE 41
5.1.1. ASPEKTE DER GEWEBEAUFBEREITUNG UND NUKLEINSAEURE-ISOLIERUNG 41
5.1.1.1. VERHINDERUNG DES VORZEITIGEN RNA-ABBAUS DURCH RNASEN 41
5.1.1.2. MASSNAHMEN ZUR KONTAMINATIONSVERMEIDUNG 42
5.1.2. ASPEKTE ZU QUALITAET UND QUANTITAET DER ISOLIERTEN NUKLEINSAEUREN 42
5.1.2.1. PROBLEMATIK DER GLEICHZEITIGEN DNA- UND RNA-GEWINNUNG 42
5.1.2.2. QUALITAETSNACHWEISE DER ISOLIERTEN NUKLEINSAEUREN 43
5.1.3. BEURTEILUNG DER PCR ALS METHODE ZUM VIRUSNACHWEIS 44
5.1.4. BEURTEILUNG DER SEQUENZIERUNGSMETHODIK 45
5.2. DISKUSSION DER ERGEBNISSE 45
5.2.1. SENSITIVITAETSBESTIMMUNGEN DER NESTED PCR ~~ 45
5.2.2. VIRUSNACHWEIS BEI MYOKARDBIOPSIEN 46
5.2.2.1. ENTEROVIREN 48
5.2.2.2. ADENOVIREN 50
5
.
2
.
23
.
ENTERO- UND ADENOVIREN - EINE VIRALE CO-INFEKTION? 51
5.2.2.4. CYTOMEGALIEVIREN 53
5.2.2.5. EPSTEIN-BARR-VIREN 54
5.2.2.6. VIRUSNACHWEIS IM KONTEXT IMMUNHISTOLOGISCHER KRITERIEN 55
5.2.3. BEDEUTUNG DER SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE 58
5.3. PATHOGENESE DER MYOKARDITIS - EIN ZUSAMMENHANG ZUR
DILATATIVEN KARDIOMYOPATHIE? 59
5.4. ASPEKTE ZUR THERAPIE 62
ZUSAMMENFASSUNG 65
LITERATURVERZEICHNIS 68
ANHANG
VI
ERKLAERUNG ZUR EIGENSTAENDIGEN ABFASSUNG DER ARBEIT
XVII
LEBENSLAUF
XVIN
DANKSAGUNG
XIX |
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