Strukturanalyse und transkriptionelle Regulation des TRAF-1-Promotors:
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2001
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1
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INHALTSVERZEICHNIS
O. ABKFIRZUNGSVERZEICHNIS 3
1. EINLEITUNG
4
1.1. DIE TNF -REZEPTOR- SUPERFAMILIE UND IHRE
T.IGANDEN 4
1.2. TNFR-SUPERFAMILIE ASSOZIIERTE PROTEINE 6
1.2.1. DIE FAMILIE DER TRAF-PROTEINE 6
.2.2. TRAF-1 UND TRAF-1-PROMOTOR 8
1.3. TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 9
1.3.1. NF-KB 9
1.3.2. EBNA-2 UND LMP-1 15
1.4. FRAGESTELLUNG _ 16
2. MATERIAL 17
2.1. CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN 17
2.2. HAEUFIG VERWENDETE PUFFER UND LOSUNGEN 18
2.3. KITS UND ENZYME ZUR DNA-PRAEPERATION 19
2.4. TRAF-1-PROMOTOR 20
2.5. PLASMIDE 20
2.6. OLIGONUKLEOTIDE 20
2.7. PROKARIONTISCHER ZELLSTAMM 20
2.8. HUMANE ZELLINIEN* 20
3. METHODEN 21
3.1. ARBEITEN MIT NUKLEINSAEUREN 21
3.1.1. POLYMERASE-KETTENREAKTION 21
3.1.2. GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN IN
AGAROSEGELEN 21
3.1.3. EXTRAKTION VON NUKLEINSAEUREN AUS AGAROSEGELEN 22
3.1.4. BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION 22
3.1.4.1. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 22
3.1.4.2. BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION IN AGAROSEGELEN 22
3.1.5. SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 22
3.1.6. LIGATION VON NUKLEINSAEUREN 23
3.1.7. ISOLIERUNG KLEINER MENGEN VON PLASMID-DNA 23
3.1.7.1. ISOLIERUNG KLEINER MENGEN VON PLASMID-DNA NACH SAMBROOK ET AL.,
1989 23
3.1.7.2. ISOLIERUNG KLEINER MENGEN VON PLASMID-DNA MIT HILFE DES PLASMID
MINI KITS 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2
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3.1.8. ISOLIERUNG GROSSER MENGEN VON PLASMID-DNA 24
3.1.9. SEQUENZIEREN VON NUKLEINSAEUREN 24
3.1.10. HITZESCHOCK-TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT DNA 24
3.1.11. KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 25
3.2. ARBEITEN MIT HUMANEN ZELLKULTUREN 25
3.2.1. KULTIVIERUNG VON 293-ZELLEN 25
3.2.2. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 25
3.2.3. TRANSFEKTION UND KOTRANSFEKTION VON HUMANEN 293-ZELLEN MIT
PLASMID-DNA 26
3.2.4. STIMULATION DER TRANSFIZIERTEN 293-ZELLEN MIT TNFA, PMA, LMP-1
UND EBNA-2 26
3.2.5. AUFSCHLUSS DER ZELLEN ZUR GEWINNUNG DES LUCIFERASE-PROTEINS 26
3.2.6. LUCIFERASE-MESSUNG 27
3.3. BANDSHIFT-ASSAYS 27
3.3.1. EXTRAKTION DES PROTEINS AUS DEN ZELLEN 27
3.3.2. ELEKTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY 27
3.4. STATISTISCHE MESSMETHODE 29
4. ERGEBNISSE 30
4.1. KLONIERUNG DES TRAF-1 -PROMOTORS IN DEN VEKTOR PGL3-BASIC 30
4.2. BASALE AKTIVITAET DES PROMOTORS UND AKTIVITAET NACH STIMULATION MIT
TNFA 33
4.3. NACHWEIS VON NF-KB-SEITEN IM TRAF-1 -PROMOTOR 35
4.4. KLONIERUNG VON DELETIONSKONSTRUKTEN DES TRAF-1 -PROMOTORS 36
4.5. LUCIFERASE-ASSAYS DER MONIERTEN KONSTRUKTE OHNE UND MIT
STIMULATION DURCH TNFA, PMA, LMP-1 UND EBNA-2 41
5. DISKUSSION 49
5.1. PROMOTORSTRUKTUR UND TRANSKRIPTIONEILE REGULATION DES
TRAF-1-PROMOTORS 49
5.2. METHODIK DER PROMOTORANALYSE 49
5.3. BEDEUTUNG DER PROMOTORSTRUKTUR FUER TRAF-1 50
5.4. TRAF-1-VERMITTELTE ANTIAPOPTOSE UND IMMUNMODULATION 51
6. ZUSAMMENFASSUNG 56
7. LITERATURVERZEICHNIS
58 |
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