Etablierung eines Modellsystems zur zellulären und biochemischen Phänotypisierung von Prionproteinen unter Verwendung von GFP-PrP-Chimären:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2002 |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
V
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DIE
UEBERTRAGBAREN
SPONGIFORMEN
ENZEPHALOPATHIEN
ODER
PRIONKRANKHEITEN
1
1.2
MOLEKULARBIOLOGIE
DER
UEBERTRAGBAREN
SPONGIFORMEN
ENZEPHALOPATHIEN
ODER
PRIONKRANKHEITEN
3
1.3
STUDIEN
ZUR
PATHOGENESE
DER
TSES
5
1.4
STUDIEN
ZUR
BIOGENESE
UND
ZELLBIOLOGIE
VON
PRP
C
,
PRP
80
UND
PRP-MUTANTEN
10
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
15
2.1
MATERIAL
15
2.1.1
CHEMIKALIEN
15
2.1.2
ENZYME
UND
ANTIBIOTIKA
15
2.1.3
YYKITS
"
ZUR
BEHANDLUNG
VON
DNA
16
2.1.4
DNA-UND
PROTEIN-YYSTANDARDS
"
16
2.1.5
VERBRAUCHSMATERIAL
ZUM
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
UND
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
17
2.1.6
VERBRAUCHSMATERIAL
FUER
YYWESTERN
BLOTS"
17
2.1.7
LOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
ARBEITEN
MIT
DNA
18
2.1.8
LOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
PROTEINARBEITEN
UND
ARBEITEN
IN
DER
ZELLKULTUR
19
2.1.9
NAEHRMEDIUM
FUER
DIE
MIKROBIOLOGIE
21
2.1.10
MEDIUM
FUER
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
21
2.1.11
MEDIENZUSAETZE
UND
GEPUFFERTE
SALZLOESUNGEN
21
2.1.12
ZELLKULTURMEDIUM
22
2.1.13
ESCHERICHIA
CO/I-STAEMME
22
II
2.1.14
EUKARYONTISCHE
ZELLLINIEN
22
2.1.15
MUTAGENESE-OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
23
2.1.16
PLASMIDE
24
2.1.17
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
26
2.2
MIKROBIOLOGISCHE
UND
GENETISCHE
ARBEITSMETHODEN
27
2.2.1
LAGERUNG
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
27
2.2.2
STAMMHALTUNG
VON
E.
CO/I-KULTUREN
27
2.2.3
ANZUCHTBEDINGUNGEN
UND
WACHSTUMSMESSUNG
27
2.2.4
PRAEPARATION
VON
KOMPETENTEN
E.
CO/I-ZELLEN
27
2.2.5
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
28
2.2.6
ALLGEMEINE
METHODEN
ZUM
ARBEITEN
MIT
DNA
28
2.2.6.1
FAELLUNG
VON
DNA
MIT
ETHANOL
28
2.2.6.2
EXTRAKTION
VON
DNA
MIT
PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL
29
2.2.6.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER
DNA
29
2.2.6.4
SPALTUNG
DER
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
29
2.2.7
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
30
2.2.7.1
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
30
2.2.7.2
MIDIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(QIAGEN-METHODE)
30
2.2.7.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
31
2.2.8
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
31
2.2.9
PRAEPARATION
VON
DNA
FUER
DIE
SUBKLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
PLASMIDVEKTOREN
32
2.2.9.1
AUFFUELLEN
VON
3'-ZURUECKLIEGENDEN
DNA-ENDEN
32
2.2.10
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
PLASMIDVEKTOREN
32
2.2.11
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
33
2.2.12
DNA-SEQUENZANALYSE
34
2.2.12.1
YYCYCLE
SEQUENCING
"
-REAKTIONEN
34
2.2.12.2
DAS
SEQUENZGEL
35
M
2.3
METHODEN
ZUR
ARBEIT
MIT
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
UND
FUER
PROTEINARBEITEN
36
2.3.1
TRYPSINIEREN
VON
ZELLEN
36
2.3.2
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
37
2.3.3
AUFTAUEN
UND
REVITALISIEREN
VON
ZELLEN
37
2.3.4
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
38
2.3.5
KONFOKALE
LASERSCANNING-MIKROSKOPIE
38
2.3.6
FIXIERUNG
UND
PERMEABILISIERUNG
VON
ZELLEN
39
2.3.7
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
39
2.3.8
MARKIERUNG
VON
ZELLULAEREN
BESTANDTEILEN
UND
ZELLORGANELLEN
MIT
FLUORESZENZFARBSTOFFEN
40
2.3.9 ENZYMATISCHE
ABTRENNUNG
GPI-YY
VERANKERTER
"
PROTEINE
VON
DER
ZELLMEMBRAN
40
2.3.10
ZELLLYSE
UND
PRAEPARATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
ZELLKULTUREN
41
2.3.11
DEGLYKOSYLIERUNG
VON
GLYKOPROTEINEN
41
2.3.12
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
41
2.3.13
KONZENTRIERUNG
DER
PROTEINEXTRAKTE
42
2.3.14 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
42
2.3.15
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
ELEKTROPHORETISCH
AUFGETRENNTER
PROTEINE
(YYWESTERN
BLOT
"
)
44
3.
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
45
3.1
ETABLIERUNG
EINES
MODELLSYSTEMS
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DES
ZELLULAEREN
TRANSPORTS
IN
LEBENDEN
ZELLEN
45
3.1.1
KONSTRUKTION
EINER
PRP-CHIMAERE
MIT
DEM
GRUENEN
FLUORESZENZPROTEIN
(GFP)
45
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
GFP-PRP-EXPRESSION:
DIE
BIOCHEMISCHE
UND
ZELLULAERE
PROZESSIERUNG
VON
GFP-WTPRP
IST
VERGLEICHBAR
MIT
DER
VON
NATIVEM
PRP
48
3.2.1
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
BIOSYNTHESE
VON
GFP-WTPRP
48
3.2.2
ANALYSE
DER
ZELLULAEREN
PROZESSIERUNG
VON
GFP-WTPRP
51
IV
3.2.2.1
GFP-WTPRP
WIRD
WIE
NATIVES
PRP
ENTLANG
EINES
SEKRETORISCHEN
PFADES
TRANSPORTIERT
51
3.2.2.2
GFP-WTPRP
WEIST
WIE
NATIVES
PRP
EINE
GPI-YYVERANKERTE
"
MEMBRANSTAENDIGKEIT
AUF
56
3.2.2.3
GFP-PRP-KONTROLL-FUSIONSPROTEINE
WEISEN
IM
GEGENSATZ
ZU
GFP-WTPRP
KEINEN
SEKRETORISCHEN
TRANSPORT
AUF
57
3.3
ERWEITERUNG
DES
MODELLSYSTEMS:
UNTERSUCHUNGEN
VON
PRP-MUTANTEN
DURCH
DEN
EINSATZ
VON
GFP-PRP-CHIMAEREN
59
3.3.1
KONSTRUKTION
VON
GFP-PRP-MUTANTEN
59
3.3.2
EXPRESSION
DER
GFP-PRP-MUTANTEN
62
3.3.2.1
ANALYSE
DER
BIOSYNTHESE
DER
GFP-PRP-MUTANTEN
62
3.3.2.2
PROTEINASE
K-RESISTENZANALYSE
DER
GFP-PRP-MUTANTEN
67
3.3.3
LOKALISATIONSSTUDIEN
DER
GFP-PRP-MUTANTEN
MIT
HILFE
DER
KONFOKALEN
LASERSCANNING-MIKROSKOPIE
68
3.3.3.1
EINIGE
GFP-PRP-MISSENSE-MUTANTEN
WERDEN
WIE
GFP-WTPRP
SEKRETORISCH
ZUR
ZELLMEMBRAN
TRANSPORTIERT
69
3.3.3.2
DIE
NONSENSE-MUTANTEN
GFP-PRP
W144X
UND
GFP-PRP
Q159X
WEISEN
EINE
CYTOPLASMATISCHE
UND
NUKLEAERE
LOKALISATION
AUF
72
3.3.3.3
INTRAZELLULAERE
AKKUMULATION
DER
GLYKOSYLIERUNGS-MUTANTEN
76
3.3.3.4
ABNEHMENDER
TRANSPORT
DER
GFP-PRP-CHIMAEREN
ZUR
ZELLMEMBRAN
MIT
ZUNEHMENDER
ANZAHL
DER
OKTAPEPTIDE
VON
PRP
80
4.
DISKUSSION
84
5.
ZUSAMMENFASSUNG
96
6.
LITERATURVERZEICHNIS
97
7.
INTERNETSEITEN
124 |
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