Organ- und Zell-spezifische Expressionsanalyse von Annexin VI in Rattenorganen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
1*
EINLEITUNG.
.
9
1.1.
C
A
2+
ALS
INTRAZELLULAERER
S
ECOND
-M
ESSENGER
.
9
1.2.
S
TRUKTUR
UND
F
UNKTION
DER
A
NNEXINE
.
13
1.2.1.
P
RIMAERSTRUKTUR
.13
1.2.2.
C
A
2+
-B
INDUNGSSTELLEN
.
16
1.2.3.
M
EMBRANBINDUNG
.17
1.2.4.
B
EDEUTUNG
DER
N
TERMINALEN
R
EGION
.19
1.2.5.
G
EWEBEVERTEILUNG
.
19
1.2.6
F
UNKTIONEN
DER
A
NNEXINE
.
20
I.2.6.I.
INTRAZELLULAERE
FUNKTIONEN
.21
I.2.6.2.
EXTRAZELLULAERE
FUNKTIONEN
.
23
13.
S
TRUKTUR
UND
F
UNKTION
VON
A
NNEXIN
VI
.25
1.3.1.
P
RIMAERSTRUKTUR
.
25
1.3.2.
B
IOCHEMISCHE
E
IGENSCHAFTENDES
P
ROTEINS
.
27
1.3.3.
Z
ELL
-
UND
G
EWEBEVERTEILUNG
.
28
1.3.4.
F
UNKTIONEN
VON
A
NNEXIN
VI
.
29
1.4.
A
UFGABENSTELLUNG
DER
A
RBEIT
.
.
34
1
ERGEBNISSE
.
36
11.
C
HARAKTERISIERUNG
DES
P
EPTID
-
SPEZIFISCHEN
A
NTISERUMS
.
36
2.1.1.
N
ACHWEIS
DER
S
PEZIFITAET
.
36
2.1.2.
T
ITERBESTIMMUNG
DES
P
EPTID
-
SPEZIHSCHEN
A
NTISERUMS
624
(1-7)
.
37
2.1.3.
S
PEZIFITAET
DES
P
EPTID
-
SPEZIFISCHEN
A
NTISERUMS
.
38
2.1.3
1.
TESTUNGDESPEPTID-SPEZIFISCLIENANTISERUMSAMNATIVENUNDDENATURIERTENPROTEINMITTELSELISA
.
38
2.1.3.2.
TESTUNG
DES
PEPTID-SPEZIFISCHEN
ANTISERUMS
UNTER
NATIVEN
UND
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
IM
INUNUNBLOT
.
40
12.
R
EINIGUNG
DER
P
EPTID
-
SPEZIFISCHEN
I
MMUNGLOBULINE
DURCH
I
MMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
41
2.2.1.
R
EINIGUNG
.
.
41
2.2.2.
N
ACHWEIS
DER
S
PEZIFITAET
DER
R
EINIGUNGSSCHRITTE
.
42
13.
O
RGANSPEZIFISCHE
E
XPRESSIONSANALYSE
DES
A
NNEXIN
VI
IN
R
ATTENORGANEN
.
44
2.3.1.
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXIN
VI
IN
R
ATTENORGANEN
.
44
2.3.2.
Q
UANTITATIVER
V
ERGLEICH
DES
V
ORKOMMENS
VON
A
NNEXIN
VI
IN
UNTERSCHIEDLICHEN
O
RGANEN
.
DER
R
ATTE
.
48
14.
Z
ELLSPEZIFISCHE
E
XPRESSIONSANALYSEN
VON
A
NNEXIN
VI
IN
R
ATTENORGANEN
.
49
2.4.1.
E
NTWICKLUNGEESES
V
ERFAHRENS
ZUR
D
EMASKIERUNG
VON
A
NTIGENEN
IM
G
EWEBESCHNITT
.
49
2.4.1.1.
DENATURIERUNGSVERFAHREN
UNTER
HITZEEINWIRKUNG
.
49
2.4.I.2.
DENATURIERUNGSVERFAHREN
UNTER
VERWENDUNG
VON
DETERGENTIEN
.
49
2.4.2.
I
MMUNHISTOCHEMISCHER
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXES
VI
NS
O
RGANEN
UND
Z
ELLEN
DER
R
ATTE
.
51
2.4.2.1,
NERVENSYSTEM
.
51
2.4.2.2.
VERDAUUNGSTRAKT
.51
2.4.2.3.
IMMUN
SYSTEM
.
52
2.4.2.4.
UROGENITALSYSTEM
.
52
2.4.2.5.
BEWEGUNGSAPPARAT
.
53
2.4.2.5.1.
QUERGESTREIFTE
SKELETT
UNDHERZMUSKULATUR
.
53
2.4.2.5.2.
EXTRA-UND
INTRAVASALE
GLATTE
MUSKULATUR
.
53
2.5.
T
AB
.
3:
Z
USAMMENFASSUNG
DER
E
RGEBNISSE
AUS
I
MMUNBLOT
,
ELISA
UND
I
MMUNHISTOCHEMIE
60
2.6.
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXIN
VI
IN
M
USKELGEWEBEN
VERSCHIEDENER
S
PEZIES
_
_
61
2.6.1.
Q
UALITATIVER
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXIN
VI
IN
M
USKELGEWEBEN
VERSCHIEDENER
S
PEZIES
.61
2.6.2.
I
MMUNHISTOCHEMISCHER
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXIN
VI
IN
M
USKELGEWEBEN
VERSCHIEDENER
S
PEZIES
63
2.7.
E
XPRESSION
DES
A
NNEXIN
VI
IN
VERSCHIEDENEN
KULTIVIERTEN
Z
ELLLINIEN
_
.
_
65
2.7.1.
N
ACHWEIS
DES
A
NNEXIN
VI
IN
VERSCHIEDENEN
KULTIVIERTEN
Z
ELLLINIEN
.
65
2.7.2.
U
NTERSUCHUNGEN
ZUR
INTRA
/
EXTRAZELLULAREN
L
OKALISATION
DES
A
NNEXIN
VI
.
66
2.8.
R
EKOMBINATION
DER
A
NNEXIN
VI-CDNA
IN
DEN
P
RSET-E
XPRESSIONSVEKTOR
ZUR
R
EINIGUNG
_
DES
P
ROTEINS
IN
NATIVER
F
ORM
.
68
2.8.1.
G
EWINNUNGVONP
B
LUESCRIPT
II
SK/A
NNEXIN
VI
C
DNA
AUS
E.
COU
.
68
2.8.2.
A
NALYSE
DES
I
NSERTS
DURCH
R
ESTRIKTION
.
69
2.8.3.
I
SOLIERUNG
DER
A
NNEXIN
VI-CDNA
.71
2.8.4.
DER
P
RSET-V
EKTOR
.71
2.8.5.
I
NTEGRATION
DER
A
NNEXIN
VI
C
DNA
IN
DEN
P
RSET-V
EKTOR
UND
T
RANSFORMATION
DER
REKOMBINANTEN
P
RSET-/A
NNEXIN
VI-P
LASMIDE
IN
E.COLI
(HB
101
UND
IM
109-S
TAEMME
)
.
73
2.8.6.
A
NALYSE
DER
P
LASMTO
-DNA
VON
POSITIVEN
T
RANSFORMANDEN
(K
LONE
)
DURCH
R
ESTRKTIONSANALYSE
.
73
2.8.7.
E
XPRESSION
VON
A
NNEXIN
VI
IN
E.
COU
.
75
2.8.7.1.
PHAGENINDUKTION
UND
EXPRESSION
.
75
3.
DISKUSSION
_
77
3.1.
C
HARAKTERISIERUNG
DES
P
EPTID
-
SPEZIFISCHEN
A
NTI
-A
NNEXIN
VI-A
NTISERUMS
.
_.----
77
3.2.
O
RGANSPEZIFISCHE
E
XPRESSIONSANALYSE
(I
MMUNBLOT
UND
ELISA-A
NALVSEN
)
_
.
78
3.3.
IMMUNH1STOCHEM1SCHE
LOKALISATION
VON
ANNEXES
VI
_
_
79
3.4.
S
UBZELLULAERE
L
OKALISATION
VON
A
NNEXES
VI
AM
B
EISPIEL
DER
L
EBER
UND
DER
M
USKULATUR
81
3.5.
E
XPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN
DES
A
NNEXES
VI
IN
VERSCHIEDENEN
KULTIVIERTEN
Z
ELLLINIEN
.
87
3.5.1.
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXES
VI
IN
A
UND
N-Z
ELLEN
(M
ORRIS
-H
EPATOM
)
.
87
3.5.2.
N
ACHWEIS
VON
A
NNEXES
VI
ES
HUMANEN
Z
ELLUNIEN
.
87
3.5.3.
INTRA
/
EXTRAZELLULAERE
L
OKALISATION
.
88
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
90
5.
MATERIAL
UND
METHODEN
_
92
5.1.
M
ATERIALIEN
_
.
-------
.
--------
.
-----
.
-
.
.
92
5.1.1.
G
ERAETE
.
92
5.1.2.
C
HEMIKALIEN
UND
V
ERBRAUCHSWAREN
.
92
5.1.3.
A
NTIKOERPER
.
92
5.1.4.
VERWENDETE
L
OESUNGEN
UND
P
UFFER
.
93
5.2.
V
ERSUCHSTIERE
,
Z
ELLLINIEN
UND
B
AKTERIENSTAEMME
.
93
5.2.1.
V
ERSUCHSTIERE
UND
H
EPATOME
.
93
5.2.2.
ZELLLINIEN
.
93
5.2.3.
B
AKTERIENSTAEMME
.
93
53.
M
ETHODEN
.
94
5.3.1.
P
ROTEINBIOCHEMISCHE
M
ETHODEN
.
94
5.3.1.1.
ALLGEMEINE
PROTEINBIOCHEMISCHE
VERFAHREN
.
94
5.3.1.1
1.
PROTEINBESTIMMUNG
.
94
5.3.1.1.2.
DIALYSE,
KONZENTRATION
UND
FAELLUNG
VON
PROTEINPROBEN
.
94
5.3.L2.
VERFAHREN
ZUR
ISOLIERUNG
VON
MEMBRANFRAKTIONEN
.
94
5.3.1.2.1.
HERSTELLUNG
VON
ORGANHOMOGENATEN
.
94
5.3.1.2.2.
SOLUBILISIERUNG
VON
MEMBRANPROTEINEN
.
94
5.3.1.2.3.
CA*
-KOMPLEXIERUNG
.
95
5.3.I.2.4.
HERSTEUUNGVONMUSKELHOMOGENATEN:
.
95
5.3.1.3.
CHROMATOGRAPHISCHE
VERFAHREN
.
96
5.3.I.3.I.
DIREKTELMMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
96
5.3.1.3.2.
IMMOBILISIERUNG
VON
PEPTIDEN
ZUR
REINIGUNG
VON
ANTIGEN-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
.
96
5.3.1.3.3.
IMMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
97
5.3.1.3.4.
IMMOBILISIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
ZUR
IMMUNAFFINITAETSREINIGUNG
VON
SPEZIFISCHEN
ANTIGENEN
.
97
5.3.1.4.
ELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
.
98
5.3.I.4.I.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
98
5.3.1.4.2.
WESTEM-BLOTTING
.
100
5.3.1.5.
FAERBEMETHODEN
.
100
5.3.I.5.I.
FAERBUNGEN
VON
PAGE-GELEN
.
100
5.3.1.5.1.1.
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE-BLAU
G-250
.
100
5.3.I.5.I.2.
SILBERFAERBUNG
.
100
5.3.I.5.2.
FAERBUNGEN
VON
BLOT-MATRICES
.
101
5.3.1.5
2.1.
FAERBUNG
MIT
PONCEAU-ROT
.
101
5.3.1.6.
IMMUNOLOGISCHE
VERFAHREN
.
102
5.3.I.6.I.
FRAKTIONIERUNG
POLYKLONALER
IGG'S
UEBER
PROTEIN
A-SEPHAROSE
.
102
5.3.1.6.2.
ELISA
.
102
5.3.I.6.3.
IMMUNBLOT
.
103
5.3.1.6.4,
IMMUNHISTOCHEMISCHE
METHODEN
.
104
5.3.I.6.4.I.
HERSTELLUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
.
104
5.3.I.6.4.2.
ANTIGEN-DEMASKIERUNGSVERFAHREN
AM
GEWEBESCHNITT
.
104
5.3.1.6.4.2.1,
DENATURIERUNGSVERFAHRENUNTERHITZEEMWIRKUNG
.
104
5.3.1.6.4
2.2.
DENATURIERUNGSVERFAHREN
UNTER
VERWENDUNG
VON
DETERGENTIEN
.
104
5.3.1.6.4.2.3,
IMMUNHISTOCHEMISCHEFAERBUNGEN
.
104
5.3.I.6.4.2.4.
INHIBITIONSTEST:
.
105
5.3.I.6.4.2.5.
IMMUNFLUOROSZENZ-MIKROSKOPIE
.
105
5.3.I.6.5.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
105
5.3.2.
Z
ELLBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
106
5.3.2.1.
MEDIEN
.
106
S.3.2.2.
ALLGEMEINE
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
106
5.3.2.3.
ZELLEXTRAKTION
.
106
5.3.3.
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
106
5.3.3.1.
NAEHNNEDIEN
FUER
BAKTERIEN
.
106
5.3.3.2.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
107
5.3.3.3.
METHODEN
.
108
5.3.3.3.I.
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
.
108
5.3.3.3.2.
SCHNELLE
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(MINILYSAT)
.
108
5.3.3.3
3.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(MIDI-LYSAT-METHODE,
QIAGEN)
.
109
5.3.3.3.4.
REINIGUNG
VON
DNA
DURCH
PHENOLEXTRAKTION
.
110
5.3.3.3.5.
ETHANOLFAEUUNG/ISOPROPANOLFAELHMG
.
110
53.3.3.6.
PHOTOSPEKTROMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
110
5.3.3.3.7.
SPALTUNG
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.
.
110
5.3.3.3.8.
DNA-GELELEKTROPHORESE
.
111
5.3.3.3.8.I.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
111
S.3.3.3.8.2.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
112
S.3.3.3.9.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
ELEKTROPHORESEGELEN
.
112
5.3.3.3.9.1,
FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
.
112
5.3.3.3.9.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
DURCH
DIE
QIAGEN-METHODE
.
113
5.3.3.3.10.
TRANSFORMATION
VON
DNA
IN
BAKTERIEN
.
113
5.3.3.3.10.1.
VORBEREITUNG
DER
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
113
5.3.3.3.10.2.
TRANSFORMATIONSSCHRITT
.
113
5.3.3.3.10.3
SELEKTION
DER
TRANSFORMANDEN
.
113
5.3.3.3.10.4.
ANALYSE
DER
TRANSFORMANDEN
.
114
5.3.3.3.11.
ANLEGEN
VON
GLYCERINKULTUREN
.
114
5.3.3.3.12.
REKOMBINATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
114
5.3.3.3.13.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEMANNEXIN
VI
IMPRSET-VEKTOR
.
115
5.3.3.3.13.1.
M13-PHAGE
.
115
5.3.3.3.13.2.
VORBEREITUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
UND
TRANSFORMATIONSSCHRITT
.
115
5.3.3.3.13.3.
PBAGENTITERBESTIMMUNG
.
115
5.3.3.3.13.4.
PHAGENKONTROLLE
UND
ANSETZEN
EINES
NEUEN
PHAGENSTOCKS
.
116
5.3.3.3.13.5.
EXPRESSION
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
.
116
6.
LITERATUR
.
118
ANHANG
_
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
LEBENSLAUF
DANKSAGUNG |
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