Ein menschliches Hyperekplexiegen in transgenen Mäusen: Etablierung und Analyse eines neuronalen Krankheitsmodells
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. DIE STRUKTUR DES INHIBITORISCHEN GLYZINREZEPTORS 1
1.2. DIE KOMPONENTEN DER GLYR 3
1.2.1. DIE GLYR A - UNTEREINHEIT 3
1.2.2. DIE GLYR SS - UNTEREINHEIT 6
1.2.3. DIE ROLLE DES GEPHYRINS 7
1.3. MUTATIONEN DES GLYZINREZEPTORS: PATHOLOGISCHE ERSCHEINUNGEN 8
1.3.1. DIE HYPEREKPLEXIE IM MENSCHEN 9
1.3.2. GLYZINREZEPTORDEFEKTE MAUSMUTANTEN 10
1.3.2.1. DIE MAUSMUTANTE
SPASTIC (SPA) 10
1.3.2.2. DIE MAUSMUTANTE
OSCILLATOR (OT) 11
1.3.2.3. DIE MAUSMUTANTE
SPASMODIC (SPD) 12
1.4. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 12
2. MATERIAL UND METHODEN 13
2.1. MATERIALIEN 13
2.1.1. BEZUGSQUELLEN 13
2.1.2. RADIOCHEMIKALIEN 14
2.1.3. GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIAL 15
2.1.4. BAKTERIENSTAMME 15
2.1.5. ANTIKOERPER 15
2.1.6. OLIGONUKLEOTIDE 16
2.1.7. LOSUNGEN 16
2.2. METHODEN 17
2.2.1. KLONIERUNG VON DNA 17
2.2.1.1. EXTRAKTION VON NUKLEINSAEUREN 17
2.2.1.2. FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 17
2.2.1.3. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 18
2.2.1.4. HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN 18
2.2.1.5. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 18
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.1.6. REPLIKABLOTTING VON BAKTERIENKOLONIEN AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN ("COLONY LIFT") 18
2.2.2. PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN 19
2.2.2.1. PLASMIDPRAEPARATION IN KLEINEM MASSSTAB ("MINI-PRAEP") 19
2.2.2.2. PLASMIDPRAEPARATION IN GROSSEM MASSSTAB ("MAXI-PRAEP") 19
2.2.2.3. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 20
2.2.2.4. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 20
2.2.2.5. DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5'-UEBERHAENGEN MIT CIP
(ALKALISCHE PHOSPHATASE AUS KAELBERDARM) 20
2.2.2.6. LIGATION VON DNA 21
2.22.1.
HERSTELLUNG DER TRANSGENKONSTRUKTE 21
2.2.3. HERSTELLUNG UND ANALYSE TRANSGENER MAEUSE 22
2.2.3.1. VORBEREITEN DER DNA 22
2.2.3.2. HERSTELLUNG TRANSGENER MAEUSE 22
2.2.3.3. HALTUNG VON MAEUSEN 22
2.2.3.4. PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS SCHWANZBIOPSIEN 22
2.2.3.5. TRANSFER VON DNA AUF NYLONMEMBRANEN {SOUTHERN BLOT) 23
22.3.6.
RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA NACH DER
"RANDOM-PRIMING"-METHODE 23
22.3.1.
HYBRIDISIERUNG 23
2.2.3.8. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 24
2.2.3.9. ISOLATION VON RNA AUS GEWEBEN 24
2.2.3.10. GELELEKTROPHORESE VON RNA 25
2.2.3.11. TRANSFER VON RNA AUF NYLONMEMBRANEN (NORTHERN BLOT) 25
2.2.3.12. SYNTHESE VON CDNA 25
2.2.3.13. PRAEPARATION VON MEMBRANPROTEINEN AUS GEWEBEN 26
2.2.3.14. AUFTRENNEN VON PROTEINEN IM SDS-POLYACRYLAMIDGEL
UND
WESTERN-BLOT 26
2.2.3.15. DETEKTION VON PROTEINEN AUF MEMBRANEN 27
2.2.3.16. FIXIEREN UND PARAFFINIEREN VON GEWEBE 27
2.2.3.17. "IN SITU"-HYBRIDISIERUNG 28
2.2.3.18. REZEPTORAUTORADIOGRAPHIE 29
3
. ERGEBNISSE 31
3.1. HERSTELLUNG DER DNA-KONSTRUKTE 31
3.2. ERZEUGUNG TRANSGENER MAEUSE 32
3.3. ANALYSE DER TRANSKRIPTION DES TRANSGENS
IM NERVENSYSTEM DER AI-TRANSGENEN MAEUSE 35
3.3.1. IDENTIFIKATION DER DAS TRANSGEN EXPRIMIERENDEN LINIEN 35
3.3.2. NACHWEIS DES TRANSGENPRODUKTS AUF PROTEINEBENE 36
3.3.3. NACHWEIS EKTOPISCHER TRANSGENEXPRESSION 37
3.3.4. LOKALISATION DER TRANSGENEN GLYRAL -EXPRESSION 40
3.4. DER PHAENOTYP DER TG271 Q-LINIEN 42
3.5. DER PHAENOTYP DER TG271R-LINIEN 46
3.6. GENETISCHE RETTUNG DER MAUSMUTANTE OSCILLATOR 47
3.7. LIGANDENBINDUNG AN TRANSGENEN GLYR 49
3.8. ELEKTROPHYSIOLOGIE DER TRANSGENEN GLYZINEZEPTOREN 53
3.9. UEBERPRUEFUNG DER GABA
A-BINDUNGSSTELLEN 55
4. DISKUSSION 57
4.1. HERSTELLUNG UND ERSTE ANALYSE DER TRANSGENSTAEMME 57
4.2. BILDUNG CHIMAERER MAUS-MENSCH-GLYR-REZEPTOREN AN ENDOGENEN
*
UND EKTOPISCHEN FUNKTIONSORTEN 58
4.3. DIE FUNKTION DER CHIMAEREN REZEPTOREN 58
4.4. VERURSACHT DIE PUNKTMUTATION DEN SPASTISCHEN PHAENOTYP? 60
4.5. EINFLUSS AUF DAS GABAERGE SYSTEM 60
4.6. DIE UEBEREXPRESSION DER HUMANEN WILDTYPUNTEREINHEIT 62
4.7. AUSBLICK 63
5. LITERATUR 65 |
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