Hemmung der Interleukin-6-Typ-Zytokin-induzierten Signaltransduktion durch dominant-negativ wirkende Formen des Zytokinrezeptors gp130:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
L
EINLEITUNG
1
1.1
Z
YTOKINE
1
1.1.1
S
TRUKTURELLE
E
INTEILUNG
DER
Z
YTOKINE
1
1.1.2
S
TRUKTURELLE
E
INTEILUNG
DER
Z
YTOKINREZEPTOREN
2
1.1.3
I
NTERLEUKIN
-6-T
YP
Z
YTOKINE
3
1.1.4
D
IE
SIGN
ALTRANSDUZIERENDE
R
EZEPTORUNTEREINHEIT
DER
I
NTERLEUKIN
-6-T
YP
Z
YTOKINE
:
GP
130
5
1.1.5
D
IE
S
IGNALTRANSDUKTION
DER
I
NTERLEUKIN
-6-T
YP
Z
YTOKINE
AM
B
EISPIEL
DES
LNTERLEUKIN-6
7
1.1.5.1
DER
JAK-STAT-SIGNALTRANSDUKTIONSWEG
7
1.1.5.2
DER
RAS-RAF-MAP-KINASE-WEG
8
1.1.5.3
WEITERE
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE,
DIE
DURCH
INTERLEUKIN-6
ANGESCHALTET
WERDEN
9
1.1.5.4
ABSCHALTUNG
DES
INTERLEUKIN-6-SIGNALS
9
1.1.6
D
IE
Z
YTOKINE
I
NTERLEUKIN
-6
UND
I
NTERLEUKIN
-
11
10
1.1.6.1
STRUKTURELLE
EIGENSCHAFTEN
DER
ZYTOKINE
INTERLEUKIN-6
UND
INTERLEUKIN-
11
UND
IHRER
A-REZEPTOREN
10
1.1.6.2
DERINTERLEUKIN-6-REZEPTORKOMPLEX
12
1.1.6.3
DER
INTERLEUKIN
11
-REZEPTORKOMPLEX
12
1.1.6.4
PHYSIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
INTERLEUKIN-6
UND
INTERLEUKIN
11
13
1.1.7
I
NTERLEUKIN
-6
UND
PATHOGENE
P
ROZESSE
14
1.1.7.1
DAS
MULTIPLE
MYELOM
14
1.1.7.2
DAS
PROSTATA-KARZINOM
15
1.2
Z
IELSETZUNG
DER
A
RBEIT
17
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
19
2.1
C
HEMIKALIEN
,
E
NZYME
UND
L
OESUNGEN
19
2.2
Z
YTOKINE
UND
LOESLICHE
R
EZEPTOREN
19
23
A
NTIKOERPER
20
2.4
P
LASMIDE
UND
A
DENOVIREN
22
2.4.1
P
LASMIDE
22
2.4.2
A
DENOVIREN
24
2.5
E
UKARYOTISCHE
Z
ELLLINIEN
UND
DEREN
K
ULTIVIERUNG
24
2.5.1
P
ERMANENTE
Z
ELLLINIEN
24
2.5.2
N
AEHRMEDIEN
UND
L
OESUNGEN
FUER
DIE
Z
ELLKULTUR
25
2.6
P
ROKARYOTISCHE
Z
ELLEN
UND
DEREN
K
ULTIVIERUNG
26
2.6.1
B
AKTERIENSTAEMME
26
2.6.2
K
ULTIVIERUNG
27
2.7
P
RAEPARATION
UND
A
NALYSE
VON
P
LASMID
-DNA
27
2.7.1
I
SOLIERUNG
VON
P
LASMID
-DNA
27
2.7.1.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IM
KLEINEN
MASSSTAB
27
2.7.1.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IM
GROSSEN
MASSSTAB
28
2.7.2
K
ONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
N
UKLEINSAEUREN
28
2.7.3
P
HENOL
/C
HLOROFORM
-F
AELLUNG
28
2.7.4
DNA-F
AELLUNG
28
2.7.5
DNA-R
ESTRIKTIONSVERDAU
29
2.7.6
H
YBRIDISIERUNG
KOMPLEMENTAERER
O
LIGONUKLEOTIDE
29
2.7.7
D
EPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
DNA
29
2.7.8
G
ELELEKTROPHORETISCHE
A
UFTRENNUNG
VON
N
UKLEINSAEUREN
30
2.7.8.1
TAE-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
30
2.7.8.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
30
2.7.9
L
IGATION
VON
DNA
31
2.7.10
T
RANSFORMATION
VON
B
AKTERIEN
31
2.7.10.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
31
2.7.10.2
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
31
2.7.11
A
UTOMATISCHES
S
EQUENZIEREN
VON
DNA
MIT
DEM
ABI
PRISM
310
S
EQUENZIERER
32
2.8
K
ONSTRUKTION
DER
GP
130-M
UTANTEN
33
2.8.1
K
ONSTRUKTION
DER
DOMINANT
-
NEGATIVEN
GP
130-M
UTANTEN
33
2.8.1.1
KONSTRUKTION
VON
PSVLGPL30AB
33
2.8.1.2
KONSTRUKTION
VON
PSVLGP
130-3
A
33
2.8.1.3
KONSTRUKTION
VON
PRC/CMVGPL30ACYT
33
2.8.1.4
KONSTRUKTION
DER
VEKTOREN
PRC/CMVGPL30AB
UND
PRC/CMVGPL30-3A
34
2.8.1.5
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PACCMVPLPAGPL30ACYT
34
2.8.2
K
ONSTRUKTION
DER
GP
130-E
XTRAZELLULAERMUTANTEN
35
2.8.2.1
KLONIERUNG
DER
GPL30Y440-EXTRAZELLULAERMUTANTEN
35
2.8.2.2
OLIGONUKLEOTIDE
35
2.8.2.3
PCR-REAKTION
36
2.9
E
XPRESSION
VON
P
ROTEINEN
IN
EUKARYOTISCHEN
Z
ELLEN
37
2.9.1
TRANSFEKTION
VON
COS7-ZELLEN
37
2.9.2
T
RANSFEKTION
VON
H
EP
G2-Z
ELLEN
37
2.9.3
S
TABILE
T
RANSFEKTION
VON
B
A
/F3-Z
ELLEN
38
2.9.4
T
RANSFEKTION
VON
Z
ELLEN
DURCH
A
DENOVIREN
38
2.9.4.1
GENERIERUNG
REKOMBINANTER
ADENOVIREN
DURCH
KOTRANSFEKTION
VON
PACCMVPLPA
UND
PJM
17
38
2.9.4.2
AMPLIFIZIERUNG
UND
ISOLIERUNG
VON
ADENOVIREN
39
2.9.4.3
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
DURCH
ADENOVIREN
39
2.10
N
ACHWEIS
VON
TRANSFIZIERTEN
UND
ENDOGENEN
P
ROTEINEN
40
2.10.1
D
URCHFLUSSZYTOMETRIE
40
2.10.2
N
ACHWEIS
DER
P
ROTEINE
IN
DER
W
ESTERN
-B
LOT
-A
NALYSE
40
2.10.2.1
HERSTELLUNG
VON
ZELLLYSATEN
UND
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
REKOMBINANTEN
UND
ENDOGENEN
PROTEINEN
40
2.10.2.2
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
41
2.10.2.3
WESTERN-BLOT-ANALYSE
42
2.11
N
ACHWEIS
DER
STAT-DNA-B
INDUNG
IM
E
LEKTROPHORETISCHEN
M
OBILITAETSSHIFT
A
SSAY
(EMSA)
43
2.11.1
H
ERSTELLUNG
VON
K
ERNEXTRAKTEN
43
2.11.2
P
ROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
B
RADFORD
44
2.11.3
R
ADIOAKTIVE
M
ARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA-S
ONDEN
45
2.11.4
E
LEKTROPHORETISCHER
M
OBILITAETSSHIFT
A
SSAY
(EMSA)
45
2.12
R
EPORTERGEN
-A
NALYSE
46
2.13
M
ESSUNG
DER
Z
ELLPROLIFERATION
47
2.14
Z
ELLZYKLUS
-A
NALYSE
48
2.15
N
ACHWEIS
DER
B
INDUNG
VON
IL-6/
S
IL-6R-K
OMPLEXE
AN
STABIL
TRANSFIZIERTE
B
A
F/3-Z
ELLEN
48
2.16
I
MMUNPRAEZIPITATION
DES
TERNAEREN
GP
130-K
OMPLEXES
48
3.
ERGEBNISSE
50
3.1
D
IE
A
KTIVIERUNG
DES
S
IGNALTRANSDUKTORS
GP
130
DURCH
IL-1
1
UND
IL-6
WIRD
DURCH
AEHNLICHE
MOLEKULARE
INTERAKTIONEN
VERMITTELT
50
3.1.1
IL-11/SIL
1
IR-K
OMPLEXE
KONKURRIEREN
MIT
IL-6/
S
IL-6R-K
OMPLEXEN
UM
DIE
B
INDUNG
AN
GP
130
50
3.1.2
G
LEICHE
E
PITOPE
DES
GP130
SIND
FUER
DIE
A
KTIVIERUNG
DURCH
IL-11/SIL-L
1R
UND
IL-6/
S
IL-6R-K
OMPLEXE
VERANTWORTLICH
52
3.1.3
D
IE
IL-11/SIL
1
1R
UND
IL-6/
S
IL-6R-K
OMPLEXE
INDUZIEREN
DIE
GLEICHE
ZEITABHAENGIGE
STAT-AKT1VIERUNG
IN
2FTGH-ZELLEN
54
3.1.4
IL-6/SIL-6R
UND
IL-11/SLL-L
1R-KOMPLEXE
INDUZIEREN
DAS
GLEICHE
STAT-A
KTIVIERUNGSMUSTER
56
3.1.4.1
ISOLIERUNG
STABIL
TRANSFIZIERTER
BA/F3-SUBKLONE
56
3.1.4.2
DIE
STAT-AKTIVIERUNG
DURCH
DIE
EINZELNEN
ADD-BACK-MUTANTEN
NACH
STIMULATION
MIT
IL-6/SIL-6R
BZW.
IL
11
/SIL
11
R
WEIST
KEINE
UNTERSCHIEDE
AUF
57
3.1.5
J
AK
I
IST
FUER
DIE
STAT-A
KTIVIERUNG
DURCH
IL-1
1/SIL-11R-KOMPLEXE
NOTWENDIG
59
3.2
U
NTERDRUECKUNG
DER
S
IGNALTRANSDUKTTON
DURCH
E
INSATZ
VON
DOMINANT-NEGATIVEN
REZEPTOREN
61
3.2.1
K
ONSTRUKTION
DOMINANT
-
NEGATIVER
R
EZEPTORFORMEN
61
3.2.2
N
ACHWEIS
DER
UE
BEREXPRESSION
DER
DOMINANT
-
NEGATIVEN
GP
1
30-M
UTANTEN
GP
1
30ACYT
UND
GP
1
30AB
62
3.2.3
B
INDUNG
VON
IL-6/
S
IL-6R-K
OMPLEXEN
AN
GP
130A
CYT
BZW
.
GP
130AB
EXPRIMIERENDE
BA/F3-ZELLEN
64
3.2.4
U
NTERDRUECKUNG
DER
STAT-A
KTIVIERUNG
NACH
T
RANSFEKTION
VON
DOMINANT-NEGATIVEN
REZEPTORFORMEN
IN
COS7-ZELLEN
67
3.2.5
U
NTERDRUECKUNG
DER
STAT
ABHAENGIGEN
G
ENINDUKTION
DURCH
E
XPRESSION
VON
DOMINANT-NEGATIVEN
REZEPTORFORMEN
IN
HEPG2-ZELLEN
69
3.2.6
D
ER
E
INFLUSS
DES
P
ROTEIN
-
TXAEGETWGS
IN
POLARISIERTEN
Z
ELLEN
HINSICHTLICH
DER
WIRKUNG
DOMINANT-NEGATIVER
REZEPTORFORMEN
70
3.2.6.1
KONSTRUKTION
DER
GPL
30-3
A-MUTANTE
70
3.2.6.2
UNTERDRUECKUNG
DER
STAT-AKTIVIERUNG
NACH
TRANSFEKTION
VON
GPL30-3A
IN
COS7-ZELLEN
71
3.2.6.3
UNTERDRUECKUNG
DER
STAT-ABHAENGIGEN
GENINDUKTION
DURCH
EXPRESSION
VON
GP
130-3
A
IN
HEPG2-ZELLEN
73
3.2.7
D
ER
E
INFLUSS
VON
DOMINANT
-
NEGATIVEM
GP
130
AUF
DIE
I
NDUKTION
DER
S
IGNALTRANSDUKTION
DURCH
WEITERE
IL-6-T
YP
Z
YTOKINE
74
3.2.7.1
EFFEKT
VON
GPL30ACYT
UND
GPL30AB
AUF
DIE
OSM-,
LIF
UND
IL-11-INDUZIERTE
STAT-AKTIVIERUNG
IN
COS7-ZELLEN
75
3.2.7.2
DER
EINFLUSS
VON
DOMINANT-NEGATIVEN
REZEPTORFORMEN
AUF
DIE
IL
11
-ABHAENGIGE
REPORTERGEN-INDUKTION
78
3.2.8
U
NTERSUCHUNG
DER
IL-6
ABHAENGIGEN
P
ROLIFERATION
VON
U266-Z
ELLEN
79
3.2.9
U
NTERSUCHUNG
DER
IL-6
ABHAENGIGEN
P
ROLIFERATION
VON
P
ROSTATA
-K
ARZINOM
-Z
ELLEN
83
3.2.10
U
NTERSUCHUNG
VON
M
UTANTEN
ZUR
NAEHEREN
E
INGRENZUNG
EINER
R
EGION
IN
DER
I
G
-
AEHNLICHEN
D
OMAENE
DES
GP
130
FUER
DIE
I
NTERAKTION
MIT
IL-6/IL-6R-K
OMPLEX
85
4.
DISKUSSION
89
4.1
IL-6
UND
IL-11
INDUZIEREN
GP130-DIMERE
MIT
GLEICHER
K
OMPLEXGEOMETRIE
90
4.2
W
AHL
DER
DOMINANT
-
NEGATIVEN
R
EZEPTORFORMEN
93
4.3
U
NTERDRUECKUNG
DER
IL-6
ABHAENGIGEN
STAT-A
KTIVIERUNG
UND
R
EPORTERGENEXPRESSION
DURCH
DOMINANT
-
NEGATIVES
GP
130
95
4.4
E
INFLUSS
DES
P
ROTEIN
-
TARGETINGS
AUF
DIE
W
IRKUNG
VON
DOMINANT
-
NEGATIVEM
GP130
97
4.5
E
INFLUSS
VON
DOMINANT
-
NEGATIVEM
GP
130
AUF
DIE
A
KTIVITAET
WEITERER
IL-6-T
YP
Z
YTOKINE
99
4.6
M
ODELLSYSTEME
FUER
IL-6
ABHAENGIGE
PATHOGENE
P
ROZESSE
102
4.7
U
NTERSUCHUNG
DES
B
INDUNGSEPITOPS
DER
I
G
-
AEHNLICHEN
D
OMAENE
DES
GP
130
105
5.
AUSBLICK
_
108
6.
ZUSAMMENFASSUNG
111
7.
LITERATUR
114
8.
ANHANG
130 |
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