NMR-Untersuchungen zur Struktur und Dynamik kleiner GTPasen und ihrer Effektoren:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
NMR-METHODEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
PROTEINEN
.
1
1.1.1
GRUNDLAGEN
UND
BEDEUTUNG
.
1
1.1.2
HERKOEMMLICHE
METHODEN
.
3
1.1.3
NEUERE
ENTWICKLUNGEN
.
5
1.1.4
31
P-NMR-SPEKTROSKOPIE
.
7
1.2
REGULATORISCHE
GTPASEN
.
8
1.2.1
SIGNALTRANSDUKTION
.
8
1.2.2
DIE
RAS-SUPERFAMILIE
.
10
1.2.3
DAS
RAS-PROTEIN
.
11
1.2.3.1
STRUKTUR
UND
FUNKTION
.
11
1.2.3.2
RAS-EFFEKTOREN
.
13
1.2.3.3
EXISTENZ
VERSCHIEDENER
KONFORMATIONEN
.
14
1.2.4
DAS
PROTEIN
RAPLA
.
17
1.2.5
DIE
KLEINE
GTPASE
ARF1
.
18
1.2.5.1
FUNKTION
UND
STRUKTUR
.
18
1.2.5.2
DER
AUSTAUSCHFAKTOR
SEC7
.
20
1.3
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
AF6
.
22
1.3.1
ENTDECKUNG
.
22
1.3.2
BIOLOGISCHE
FUNKTION
.
22
1.3.3
DEFINITION
DER
RAS-BINDENDEN
DOMAENE
VON
AF6
.
26
1.4
ZIELSETZUNG
.
29
II
INHALTSVERZEICHNIS
2
METHODEN
30
2.1
STRUKTURAUFKLAERUNG
VON
AF6-RBD
.
30
2.1.1
PROTEINEXPRESSION
UND
ISOTOPENMARKIERUNG
.
30
2.1.2
PROBENZUSAMMENSETZUNG
UND
SPEKTRENAUFHAHME
.
31
2.1.3
NMR-EXPERIMENTE
ZUR
STRUKTURAUFKLAERUNG
.
32
2.1.3.1
MEHRDIMENSIONALE
HETERONUKLEARE
EXPERIMENTE
.
32
2.1.3.2
ZUORDNUNG
DER
HAUPTKETTE
.
'
.
33
2.1.3.3
ZUORDNUNG
DER
SEITENKETTEN
.
34
2.1.4
BESTIMMUNG
DER
STRUKTURRELEVANTEN
PARAMETER
.
35
2.1.4.1
SEKUNDAERSTRUKTURVORHERSAGE
.
35
2.1.4.2
NOE-EINSCHRAENKUNGEN
.
35
2.1.4.3
WASSERSTOFFBRUECKEN
.
37
2.1.4.4
EINSCHRAENKUNGEN
FUER
DIHEDRALE
WINKEL
.
37
2.1.4.5
RESIDUALE
DIPOLKOPPLUNGEN
.
38
2.1.5
STRUKTURRECHNUNG
.
41
2.1.5.1
GRUNDLEGENDE
STRATEGIE
.
41
2.1.5.2
ERZEUGUNG
VON
STRUKTUREN
MITTELS
CNS
.
41
2.1.5.3
BEURTEILUNG
DER
RESTRAINTS
.
44
2.1.5.4
RUECKRECHNUNG
DER
SPEKTREN
MIT
RELAX
.
45
2.1.6
BESTIMMUNG
VON
RELAXATIONSRATEN
.
46
2.2
31
P-NMR-SPEKTROSKOPIE
AM
PROTEINKOMPLEX
ARFL-ARNO(SEC7)
.
48
2.2.1
PROBENPRAEPARATION
.
48
2.2.2
NMR-SPEKTROSKOPIE
.
48
2.2.3
DATENAUSWERTUNG
.
49
2.3
BERECHNUNG
VON
AUSTAUSCHRATEN
MIT
DEM
SPINDICHTEMATRIX-FORMALISMUS
.
50
2.3.1
THEORIE
DER
SIMULATION
VON
AUSTAUSCHSPEKTREN
.
50
2.3.2
DAS
PROGRAMM
LINSIM
.
51
2.3.3
BESTIMMUNG
DER
AUSTAUSCHRATEN
UND
THERMODYNAMISCHER
PARAMETER
51
2.3.4
EXPERIMENTELLE
PARAMETER
.
53
INHALTSVERZEICHNIS
III
3
ERGEBNISSE
55
3.1
DIE
STRUKTUR
DER
RAS-BINDENDEN
DOMAENE
VON
AF6
.
55
3.1.1
SEQUENTIELLE
ZUORDNUNG
.
55
3.1.2
CIS-TRANS-ISOMERIE
DER
PROLINE
.
58
3.1.3
SEKUNDAERSTRUKTUR
.
60
3.1.3.1
VORHERSAGE
DURCH
CHEMISCHE
VERSCHIEBUNGEN
.
60
3.1.3.2
PROTONEN-AUSTAUSCHMESSUNGEN
.
62
3.1.3.3
15
N-SPINRELAXATIONSZEITEN
.
63
3.1.3.4
SEKUNDAERSTRUKTURBESTIMMUNG
DURCH
NOE-KONTAKTE
.
65
3.1.4
RESTRAINTS
FUER
DIE
STRUKTURRECHUNG
.
69
3.1.4.1
NOE-KONTAKTE
.
69
3.1.4.2
WASSERSTOFFBRUECKEN
.
71
3.1.4.3
RESIDUALE
DIPOLKOPPLUNGEN
.
72
3.1.4.4
DIHEDRALE
WINKEL
.
74
3.1.5
TERTIAERSTRUKTUR
VON
AF6-RBD
.
74
3.2
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
DEN
AF6-EFFEKTOREN
RAPLA
UND
H-RAS
.
79
3.2.1
DURCHFUEHRUNG
DER
EXPERIMENTE
.
79
3.2.2
ERGEBNISSE
DER
BINDUNGSSTUDIE
MIT
RAPLA
.
80
3.2.3
ERGEBNISSE
DER
BINDUNGSSTUDIE
MIT
H-RAS
.
82
3.3
31
P-NMR-UNTERSUCHUNGEN
AM
KOMPLEX
ARFL-ARNO(SEC7)
.
85
3.3.1
ARF1
IM
GDP-GEBUNDENEN
ZUSTAND
.
85
3.3.2
DER
KOMPLEX
DES
ARF1
MIT
DEM
WILDTYP
VON
ARNO(SEC7)
.
87
3.3.3
KOMPLEXE
MIT
VERSCHIEDENEN
ARNO(SEC7)-MUTANTEN
.
89
3.3.4
ARF1
IM
GTP-GEBUNDENEN
ZUSTAND
.
94
3.4
KONFORMATIONELLE
UEBERGAENGE
IN
H-RAS
.
95
3.4.1
BEDEUTUNG
DER
MOLEKUELDYNAMIK
.
95
3.4.2
ERGEBNISSE
AM
SYSTEM
RAS(WT)-MG
2+
-GPP(CH2)P
.
96
3.4.3
ERGEBNISSE
AM
SYSTEM
RAS(T35S)-MG
2+
-GTP7S
.
98
4
DISKUSSION
102
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.1
DIE
STRUKTUR
VON
AF6-RBD
.
102
4.1.1
BEDEUTUNG
VON
RESTDIPOLKOPPLUNGEN
FUER
DIE
STRUKTURAUFKLAERUNG
.
.
102
4.1.2
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
RAS-BINDENDEN
DOMAENEN
.
104
4.1.3
MOEGLICHE
FUNKTION
DER
HELIX
AI
.
107
4.1.4
DISKUSSION
DER
RAS-EFFEKTOR-BINDUNG
.
109
4.2
ZUR
BINDUNG
DES
AUSTAUSCHFAKTORS
ARNO(SEC7)
AN
ARF1
.
116
4.3
DYNAMIK
DER
KONFORMATIONELLEN
UEBERGAENGE
IN
H-RAS
.
118
5
ZUSAMMENFASSUNG
122
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
125
LITERATURVERZEICHNIS
127
ANHANG
136
A
DIE
CHEMISCHEN
VERSCHIEBUNGEN
VON
AF6
RBD
137
B
UEBERSICHT
ALLER
ZUR
STRUKTURRECHNUNG
VERWENDETEN
RESTRAINTS
149
B.L
TALOS-WINKELRESTRAINTS
.
149
B.2
H^-N-KOPPLUNGEN
.
151
B.3
C
"
-C
'
-KOPPLUNGEN
.
153
B.4
WASSERSTOFFBRUECKEN
.
153
B.5
NOE-KONTAKTE
.
156
C
15
N-REIAXATIONSRATEN
VON
AF6-RBD
165
D
DAS
PROGRAMM
CNSSTAT
170 |
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