Herstellung und Anwendungen eines replikationsinkompetenten lentiviralen Vektorsystems:
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2001
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1. EINLEITUNG
1
1.1. LENTIVIREN 1
1.1.1. AUFBAU UND VIRALE PROTEINE 2
1.1.2. REPLIKATIONSZYKLUS DER LENTIVIREN 6
1.2. LENTIVIRALE VEKTOREN 12
1.2.1. AUFBAU REPLIKATIONSINKOMPETENTER LENTIVIRALER VEKTOREN 12
1.2.2. ANWENDUNG LENTIVIRALER VEKTOREN 15
1.3. ZIELSETZUNGEN 18
2. MATERIAL UND METHODEN 19
2.1. MATERIAL 19
2.1.1. GERAETE UND MATERIALIEN 19
2.1.2. CHEMIKALIEN. 20
2.1.3. ENZYME UND KITS 20
2.1.4. ANTIVIRALE SUBSTANZEN. 21
2.1.5. BAKTERIENSTAEMME 21
2.1.6. ZELLLINIEN 22
2.1.7. VIRUSISOLATE 22
2.1.8. PLASMIDE 22
2.1.9. OLIGONUKLEOTIDE 23
2.1.10. LOESUNGEN 24
2.1.10.1. BAKTERIENKULTUR 24
2.1.10.2. ZELLKULTUR 24
2.1.10.3. LOESUNGEN ZUR ANALYSE UND KLONIERUNG VON DNA 26
2.1.10.4. DNA-TRANSAKTION
27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.1.10.5. STANDARDLOESUNGEN UND PUFFER 28
2.1.10.6. LOESUNGEN ZUM NACHWEIS DER LUCIFERASE-AKTIVITAET 29
2.2. METHODEN 31
2.2.1. ANALYSE UND KLONIERUNG VON DNA 31
2.2.1.1. TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 31
2.2.1.2. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 32
2.2.1.3. PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION VON DNA 33
2.2.1.4. PRAEZIPITATION VON DNA 34
2.2.1.5. SPEKTROPHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN 34
2.2.1.6. POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 34
2.2.1.7. RT-PCR 36
2.2.1.8. RESTRIKTIONSVERDAU DER DNA 37
2.2.1.9. AUFFULLEN VON 5'-UEBERHAENGEN MIT DEM KLENOW FRAGMENT 37
2.2.1.10. ENTFERNUNG VON 3'-UEBERHAENGEN MIT DER T4-DNA-POLYMERASE 38
2.2.1.11. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA MIT CLAP 38
2.2.1.12. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 38
2.2.1.13. AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT DEM GENECLEAN-KIT 39
2.2.1.14. LIGATION LINEARER DNA-FRAGMENTE MIT T4-LIGASE 39
2.2.1.15. SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA 40
2.2.2. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 41
2.2.2.1. KULTIVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN
41
2.2.2.2. CALCIUMPHOSPHAT-TRANSAKTION 41
2.2.2.3. GENERIERUNG VIRALER UEBERSTAENDE ZUR TRANSDUKTION VON ZIELZELLEN
42
2.2.2.4. HEMMUNG DER PARTIKELREIFUNG DURCH ZUGABE VON PROTEASE
INHIBITOREN 43
2.2.2.5. HEMMUNG DER MARKERGENEXPRESSION DURCH ZUGABE VON RT- UND
INTEGRASE-INHIBITOREN 44
2
.
22
.
6
. TITRIERUNG VON VIRUSUEBERSTAENDEN (LACZ FAERBUNG) 44
2
.
22
.
1
. NACHWEIS DER LUCIFERASE-EXPRESSION IN INFIZIERTEN ZELLEN 45
2.2.2.8. BESTIMMUNG DER INFEKTIONSEFFIZIENZ DURCH DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE 45
2.2.2.9. KONZENTRIERUNG VIRALER PARTIKEL 46
3. ERGEBNISSE
47
3.1. ETABLIERUNG EINER PHAENOTYPISCHEN RESISTENZTESTUNG VON HIV 47
3.1.1. KLONIERUNG EINES REPLIKATIONSINKOMPETENTEN
SS-GALAKTOSIDASE-EXPRIMIERENDEN
LENTIVIRALEN VEKTORS 47
3.1.2. ANALYSE DER TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ 49
3.1.3. SS-GALAKTOSIDASE-EXPRESSION KANN DURCH ZUGABE VON RT- UND
PROTEASE-
INHIBITOREN GEHEMMT WERDEN 49
3.1.4. KLONIERUNG EINES HLV-VEKTORS MIT MULTIPLEN RESISTENZEN GEGEN
ANTIVIRALE
SUBSTANZEN 51
3.1.5. RESISTENZEN GEGEN ANTIVIRALE WIRKSTOFFE KOENNEN NACHGEWIESEN
WERDEN 52
3.1.6. ETABLIERUNG EINES PHAENOTYPISCHEN RESISTENZTESTS MIT HILFE EINES
LUCIFERASE
EXPRIMIERENDEN LENTI VIRALEN VEKTORS 53
3.1.7. KLONIERUNG UND AUSTESTUNG VON HIV-VIRUSISOLATEN MIT BEKANNTEN
RESISTENZEN 55
3.1.8. AUSTESTUNG VON RESISTENZEN VON HIV AUS DEN SERUM HIV-INFIZIERTER
PATIENTEN 55
3.1.9. AUSTESTUNG ANTIVIRALER SUBSTANZEN GEGEN DIE HIV INTEGRASE 58
3.2. ANALYSE DER PSEUDOTYPISIERBARKEIT VON HIV KAPSIDEN 59
3.2.1 .EXPRESSIONSKONSTRUKTE FUER FOAMY VIRUS-HUELLPROTEINE 59
3.2.2. ANALYSE DER TRANSDUKTIONSEFFIZIENZEN VON PSEUDOTYPISIERTEN HIV
KAPSIDE
DURCH TITRATION 62
3.2.3. ANALYSE DER RELATIVEN TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ DURCH
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE 63
3.2.4. KONZENTRIERUNG PSEUDOTYPISIERTER VIRALER PARTIKEL 65
4. DISKUSSION
67
4.1. ETABLIERUNG EINER METHODE ZUR TESTUNG DER WIRKSAMKEIT VON
ANTIVIRALEN
SUBSTANZEN BEI HIV-INFIZIERTEN PATIENTEN 69
4.2. PSEUDOTYPISIERBARKEIT VON HIV KAPSIDEN 75
5. LITERATURVERZEICHNIS 80
6. ANHANG 85
6.1. ZUSAMMENFASSUNG 85
6.2. SUMMARY 87
6.3. ERKLAERUNGEN 89
6.4. LEBENSLAUF 90
6.5. PUBLIKATIONSLISTE 91 |
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