Virulenz des Virus der klassischen Schweinepest: Charakterisierung mittels reverser Genetik
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2001
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| adam_text | Titel: Virulenz des Virus der klassischen Schweinepest
Autor: Kluge, Kristina
Jahr: 2001
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.......................................................................... 1
1.1 Klassifizierung des Virus der klassischen Schweinepest
in das Genus Pestivirus.............................................................. 1
1.2 Genomorganisation der Pestiviren................................................... 2
1.3 Das Krankheitsbild der klassischen Schweinepest............................... 4
1.4 Impfstoffe gegen die klassische Schweinepest.................................... 6
1.5 Bekämpfung der klassischen Schweinepest...................................... 8
1.6 Virulenz des Virus der klassischen Schweinepest.............................. 10
1.7 Zielsetzung........................................................................... 11
2 MATERIALUNDMETHODEN................................................ 12
2.1 Material............................................................................... 12
2.1.1 Eukaryontische Zellinien...................................................... 12
2.1.2 Virusstämme................................................................. 12
2.1.3 Bakterienstämme.............................................................. 12
2.1.4 Plasmide....................................................................... 12
2.1.5 cDNA-Klone des KSPV Jffa .............................................. 13
2.1.6 Synthetische Oligonukleotide.............................................. 13
.7 Antikörper......................................................................... 15
.8 Chemikalien.................................................................... 16
.9 Enzyme........................................................................ 17
2.1.10 Vorgefertigte Systeme (,Jdts )................................................ 17
2.1.11 Verbrauchsmaterialien........................................................... 18
2.1.12 Geräte........................................................................... 18
2.2 Methoden................................................................................ 19
2.2.1 Zellkulturtechniken.................................................................... 19
Z2.1.1 Medien und Puffer............................................................................ 19
2.2.1.2 Allgemeine Zellkulturarbeiten......................................................... 20
2.2.1.3 Infektion von PK15-Zellen.................................................. 20
2.2.1.4 Bestimmung der Zellzahl.......................................................... 20
Zil.5 Titration von KSPV........................................................... 21
2.2.1,6 Indirekte Immunperoxidase-Färbung.......................................... 21
X2.I.7 Transfektioo von RNA in PK15-Zeilen...................................... 22
2.2.1.8 Wachstumskurven............................................................... 22
2.2.2 Molekularbiologische Methoden........................................... 23
2.2.2.1 Anzucht von Bakterien...................................................................... 23
2.2.2.2 Piasrmdisolierung............................................................ 23
22.Z3 Herstellung kompetenter Bakterien............................................ 25
2.2.2.4 Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid-DNA..................... 26
2.2.2.5 Phenol/Chloroform Extraktion von DNA...................................... 26
2.2.2.6 Ethanolpräzipitation von DNA................................................. 26
2.2.2.7 Isopropanolpräzipitation von DNA........................................... 27
2.2.2.8 Quantifizierung von DNA-/RNA-Proben.............................................. 27
2.2.2.9 Restriktionsverdau von DNA................................................. 27
2.2.2.10 Dephosphorylienmg von DNA-Fragmenten.................................. 28
2.2.2.11 DNA-Agarose-Gelelektrophorese........................................... 28
2.2.2.12 Aufreinigung und Analyse von DNA-Fragmenten............................ 29
2.2.2.13 Ligation von DNA-Fragmenten............................................... 29
2.2.2.14 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................... 29
2.2.2.15 Reverse Transkription und Reverse Transkriptase Polymerase-
Kettenreation.................................................................................. 30
2.2.2.16 Klonienmg von PCR-Produkten............................................ 31
2.2.2.17 Ortsgerichtete Mutagenese mittels „QuikChange™ Site-Directed
Mutagenesis ............................................................... 31
2.2.2.18 RNA-Isolierung............................................................................... 32
2.2.2.19InvitroTranskription......................................................... 33
2.2.2.20 Aufreinigung von in vitro Transkripten....................................... 33
2.2.2.21 „Tailing einer cDNA........................................................ 33
2.2.2.22 RNA-Ligation............................................................... 34
2.2.3 Sequenzierung von DNA.................................................... 35
2.2.3.1 Radioaktive Sequenzierung................................................. 35
2.2.3.2 „Cycle-Sequencing mit Fluoreszenzfarbstoff-tnakiertem Pritner.............. 36
2.2.3.3 Elektrophorese in denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen........... 37
2.2.4 Klonierungen................................................................. 40
2.2.4.1 RT-PCR-Klonierungen noch nicht als cDNA vorliegender
Bereiche des KSPV Jffa .................................................................. 40
Z2.4.2 Herstellung des KSPV Jffa cDNA-Gesamtklones.......................... 41
2.2.4.3 Konstruktion chimarcr cDNA-Gesamtlclone..................................... 43
2.2.4.4 Reparatur des KSPV, Jffa cDNA-Gesamtklones............................ 47
2.2.4.5 Konstruktion der S -NTR-Mutanten (KSPV, Jffa ).......................... 49
Z2.4.6 Konstruktion der 3 -NTR-Mulanten (KSPV „Alfort/T )..................... 51
3 ERGEBNISSE......................................................................... 53
3.1 Charakterisierung des KSPV C-Stamm Isolates,Jffa ......................... 53
3.1.1 cDNA-Klonierung des KSPV „Iffa -Genoms........................... 53
3.1.2 cDNA-Klonierung der Region von Nukleotidposition 6809-8747.. 54
3.1.3 Bestimmung des 5~-Terminus............................................. 55
3.1.4 cDNA-Klomerangdes3*-Endes.......................................... 56
3.1.5 Bestimmung der Nukleinsäuresequenz des KSPV Jffa ................ 58
3.1.6 Analyse der ermittelten Sequenz.......................................... 59
3.1.7 Sequenzvergleiche der einzelnen Proteine................................ 60
3.1.8 Sequenzvergleiche in der 5~-NTR........................................ 61
3.1.9 Sequenzvergleiche in der 3 -NTR........................................ 62
3.2 Konstruktion eines cDNA-Gesamtklones des KSPV „Iffa ................... 65
3.2.1 Aufbau der 5~-Hälfte........................................................ 67
3.2.2 Aufbau der 3V-Hälfte........................................................ 69
3.2.3 Verknüpfung der 5~-mit der 3V-Hälfte................................... 69
3.3 In vitro Transkription KSPV ,Jffa -spezifischer RNA und
Transfektionsexperimente.......................................................... 70
3.4 Auffinden defekter Regionen in der KSPV „Iffa cDNA....................... 72
3.4.1 Konstruktion chimärer cDNA-Gesamtklone............................ 72
3.4.2 Transfektion der cRNA chimärer cDNA-Gesamtklone............... 75
3.5 Bestimmung des 3 -Terminus des KSPV Jffa ................................ 79
3.6 Konstruktion eines KSPV „Iffa cDNA-Gesamtklones
mit authentischem 3 -Terminus (pIFFj;23)....................................... 82
3.6.1 Charakterisierung des KSPV „Iffa cDNA-
Gesamtklones pIFFi23..................................................................... 83
3.7 Analyse des polyU-Traktes in der 3*-NTR.......................................... 84
3.7.1 Konstruktion von 3*-NTR Mutanten des KSPV ,Jffa
cDNA-Gesamtklones....................................................... 85
3.7.2 Konstruktion von 3*-NTR Mutanten des KSPV „Alfort/T
cDNA-Gesamtklones......................................................... 87
3.7.3 Einfluß des polyU-Traktes in der 3 -NTR auf das
Wachstumsverhalten des KSPV Jffa ................................... 88
3.7.4 Einfluß eines polyU-Traktes in der 3 -NTR auf das
Wachstumsverhalten des KSPV„Alfort/T .............................. 89
4 DISKUSSION........................................................................ 91
4.1 Analyse des Genoms des attenuierten KSPV Stammes „Iffa ................ 91
4.2 Struktur und Funktion der 3 -NTR............................................... 93
4.3 Erzeugung eines revers genetischen Systems
auf Basis von KSPV Jffa ............................................................................ 94
4.4 Funktion der polyU-Insertion in der 3~-NTR................................... 97
5 ZUSAMMENFASSUNG........................................................ 100
6 SUMMARY.............................................................................. 102
7 LITERATURVERZEICHNIS................................................. 104
8 ANHANG......................................................................................................113
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