Klonierung, Expression und Charakterisierung von rekombinanten, humanen Insulinrezeptoren:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
2001
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|---|---|
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
UND
FRAGESTELLUNG
.
8
1.1.
EINLEITUNG
.
8
1.2.
FRAGESTELLUNG
.
11
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1.
MATERIAL
.
13
2.1.1.
CHEMIKALIEN.
.
13
2.1.2.
RADIOISOTOPE
.
14
2.1.3.
KIT-SYSTEME
.
14
2.1.4.
ENZYME
.
14
2.1.5.
NUKLEINSAEUREN
.
15
2.1.6.
E.
COLI-STAENUNE
.
15
2.1.7.
ZELLINIE
.
16
2.1.8.
ANTIKOERPER
.
16
2.1.9.
LAENGEN
UND
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
.
16
2.1.10.
MEDIEN,
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
16
2.1.10.1.
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
.
16
2.1.10.2.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
17
2.2.
METHODEN
.
20
2.2.1.
ELEKTROPHORETISCHE
DNA-ANALYSE
.
20
2.2.1.1.
DNA-AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
.
20
2.2.1.2.
DNA-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
.
20
2.2.2.
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
ELEKTROPHORESE-GELEN
.
22
2.2.2.1.
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
22
2.2.2.2.
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
POLYACRYLAMID-GELEN
.
23
2.2.3.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
.
23
2.2.3.1.
RESTRIKTIONSVERDAU
DER
PLASMIDE
.
23
2.2.3.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
KLONIERUNGSVEKTOREN
.
25
2.2.3.3.
LIGATION
VON
INSERT
UND
KLONIERUNGSVEKTOR
.
25
2.2.4.
EXTRAKTION,
FAELLUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA
.
26
2.2.4.1.
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
.
26
2.2.4.2.
ETHANOL-FAELLUNG
.
27
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.43.
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA
.
27
2.2.5.
AMPLIFIKATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.COLI
.
28
2.2.5.1.
PRAEPARATION
HOCHKOMPETENTER
E.COLI
.
28
2.2.5.2.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
.
28
2.2.53.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
29
2.2.6.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
SANGER
.
29
2.2.7.
MUTATIONSVERFAHREN
.
31
2.2.7.1.
ZIELGERICHTETE
IN-VITRO-MUTAGENESE
NACH
DENG
&
NICKOLOFF.
.
31
2.2.7.2.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
34
2.2.8.
ZELLKULTUR
.
35
2.2.8.1.
TRANSFEKTION
VON
293
(HEK-)
ZELLEN
.
35
2.2.8.2.
AUSSCHLUSS
EINER
MYCOPLASMEN-KONTAMINATION
.
36
2.2.9.
PROTEINBIOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
36
2.2.9.1.
PRAEPARATION
VON
TRANSFEKTIONSPRODUKTEN
.
36
2.2.9.2.
ELEKTROPHORETISCHE
PROTEIN-ANALYSE
.
37
2.2.9.2.I.
DENATURIERENDE
PROTEIN-SDS-PAGE
.
37
2.2.9.2.2.
NICHT-DENATURIERENDE
PROTEIN-TX-100-PAGE
.
38
2.2.93.
IMMUNOBLOTTING
.
38
2.2.9.4.
CROSSLINKING
.
39
3.
ERGEBNISSE
.
41
3.1.
HERSTELLUNG,
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
INSULINREZEPTOR-EKTODOMAENE
.
41
3.1.1.
EINFUEHRUNG
.
41
3.1.2.
KONSTRUKTION
DES
REKOMBINANTEN
VEKTORS
PCDNA3.HIRECTO
.
41
3.1.2.1.
KONSTRUKTION
DES
INSERTS
.
44
3.1.2.2.
KONSTRUKTION
DES
KLONIERUNGSVEKTORS
.
48
3.1.23.
LIGATION
UND
KLONIERUNG
.
50
3.1.3.
ANALYSE
UND
SEQUENZIERUNG
DER
MONIERTEN
PLASMIDE
.
50
3.1.4.
ZELLKULTUR:
EXPRESSION
DER
INSULINREZEPTOR-EKTODOMAENE
IN
293
(HEK-)
ZELLEN
.
54
3.1.5.
NACHWEIS
DER
INSULINREZEPTOR-EKTODOMAENE
IM
ZELLUEBERSTAND
.
55
2
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.6.
INSULIN-INDUZIERTE
VERAENDERUNGEN
HYDRODYNAMISCHER
EIGENSCHAFTEN
.
56
3.2.
AUSTAUSCH
DER
CYSTEINE
26
UND
872
GEGEN
SERINE
MIT
HILFE
DER
ZIELGERICHTETEN
IN-VITRO-MUTAGENESE
NACH
DENG
&
NICKOLOFF.
.
59
3.2.1.
KONTROLLMUTAGENESE
.
59
3.2.2.
KONSTRUKTION
DER
REKOMBINANTEN
VEKTOREN
PCDNA3.HIRCYS26
UND
PCDNA3.HIRCYS872
.
59
3.2.2.I.
AUSWAHL
DER
MUTATIONS
UND
SELEKTIONS-PRIMER
.
60
3.2.2.2.
MUTAGENESE
UND
KLONIERUNG
.
61
3.2.3.
ANALYSE
UND
SEQUENZIERUNG
DER
KLONIERTEN
PLASMIDE
PCDNA3.HIRCYS26
UND
PCDNA3.HIRCYS872
.
61
3.2.4.
ZELLKULTUR:
EXPRESSION
VON
HIR-CYS26
UND
HIR-CYS872
IN
293
(HEK-)
ZELLEN
.
65
3.2.5.
NACHWEIS
VON
HIR-CYS26
UND
HIR-CYS872
IM
ZELLYSAT
.
65
4.
DISKUSSION
.
67
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
77
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
78
3 |
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