Molekulare und funktionelle Analyse des Fas/CD95-Liganden in transgenen Mäusen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
|
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INHALTSVERZEICHNIS
ABSTRACT
(ENGLISCH)
.
I
ZUSAMMENFASSUNG
(DEUTSCH)
.
II
SCHLAGWOERTER
.
III
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
IV-V
INHALTSVERZEICHNIS
.
VI-IX
1
EINLEITUNG
-
.
1
1.
1
E
IGENSCHAFTEN
UND
F
UNKTION
DES
F
AS
-L
IGANDEN
.
2
1.1.1
TNF
UND
TNFR-PROTEINSUPERFAMILIEN.
2
1.1.2
DIE
BIOLOGISCHE
FUNKTION
DES
FAS-LIGANDEN
UND
SEINES
REZEPTORS
IN
DER
MAUS
.
2
1.1.3
DIE
FASL/FAS-SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE(N)
IM
ZUSAMMENHANG
MIT
DEN
ANDEREN
SIGNALKASKADEN
.
6
1.2
E
VOLUTIONELLE
K
ONSERVIERUNG
DES
F
AS
-L
IGANDEN
ZWISCHEN
M
AUS
UND
M
ENSCH
.
9
1.3
ALLGEMEINE
A
SPEKTE
ZUR
E
XPRESSION
EINES
T
RANSGENS
.
10
1.4
M
AUSMODELLE
MIT
DER
E
XPRESSION
EINES
T
RANSGENS
UNTER
DER
K
ONTROLLE
DES
M
X
-P
ROMOTORS
.
11
1.5
Z
IELE
DIESER
P
ROMOTIONSARBEIT
.
12
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
_
13
2.1
I
SOLIERUNG
UND
A
NALYSE
VON
N
UKLEINSAEUREN
.
13
2.1.1
CHEMIKALIEN
UND
STANDARDLOESUNGEN
.
13
2.1.2
KLONIERUNG
DES
TRANSGEN-KONSTRUKTES
.
14
2.1.3
GEWINNUNG
VON
PLASMID-DNA
.
15
2.1.3.1
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
15
PRAEPARATION
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
ZELLEN
.
15
TRANSFORMATION
.
15
2.1.3.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IM
KLEINEN
MASSSTAB
(YYMINIPREP
"
)
.
15
2.13.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IN
GROESSEREM
MASSSTAB
(YYMAXIPREP
"
)
.
16
2.1.4
GEWINNUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
GEWEBEN
.
16
2.1.5
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
GEWEBEN
.
16
2.1.5.1
GESAMT-RNA
.
16
2.1.5.2
ISOLIERUNG
VON
POLYADENYLIERTER
RNA
.
17
2.1.6
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
.
18
2.1.7
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
18
PRIMERBESCHREIBUNG
.
18
PCR-REAKTIONSANSATZ
.
19
PCR-REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
20
2.1.8
SEQUENZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
20
2.1.8.1
SEQUENZIERUNG
DES
MX-FASL-KONSTRUKTES
.
20
2.1.8.2
SEQUENZIERUNG
VON
RT-PCR-PRODUKTEN
.
20
2.1.9
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
20
2.1.10
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
21
2.1.10.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
21
2.1.10.2
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
21
2.1.11
EXTRAKTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
22
2.1.12
HYBRIDISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
22
2.1.12.1
HERSTELLUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SONDEN
.
22
2.1.12.2
SOUTHEM-BLOT-VERFAHREN
.
23
2.1.12.3
NORTHEM-BLOT-VERFAHREN
.
24
2.1.12.4
RNASE-PROTEKTIONSANALYSE
(RNASE
PROTECTION
ASSAY)
.
25
2.1.13
DETEKTION
VON
32
P-MARKIERTEN
NUKLEINSAEUREHYBRIDEN
.
25
2.2
I
SOLIERUNG
UND
K
ULTIVIERUNG
VON
EMBRYONALEN
F
IBROBLASTEN
AUS
DER
M
AUS
.
26
2.2.1
MEDIEN
.
26
2.2.2
ISOLIERUNG
VON
FIBROBLASTEN
AUS
MAUS-EMBRYONEN
.
26
2.2.3
EINFRIEREN
UND
WIEDERAUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
26
2.3
P
ROTEINEXPRESSIONSANALYSEN
.
27
2.3.1
ANTIKOERPER
.
27
2.3.2
CHEMIKALIEN
UND
LOESUNGEN
.
28
2.3.3
AUFREINIGUNG
UND
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
.
29
2.3.3.1
PRAEPARATION
VON
PROTEINGEMISCHEN
AUS
MAUSORGANEN
.
29
2.3.3.2
IN
VIVO
MARKIERUNG
DER
PROTEINE
MIT
33
S-METHIONIN
.
29
2.3.3.3
IMMUNPRAEZIPITATION
.
29
2.3.3.4
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
30
2.3.4
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
.
30
2.3.4.1
ECL-VERFAHREN
(ENHANCED
CHEMILUMINESCENCE)
.
30
2.3.4.2
NACHWEIS
VON
35
S-MARKIERTEN
PROTEINEN
.
31
2.3.4.3
NACHWEIS
VON
OBERFACHEN-PROTEINEN
DURCH
FACS-ANALYSEN
.
31
2.4
H
ISTOLOGISCHE
A
NALYSEN
.
31
2.4.1
HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG
AUF
PARAFFINSCHNITTEN
.
31
2.4.2
IMMUNHISTOCHEMISCHE
ANALYSEN
AUF
GEFRIERSCHNITTEN
.
32
2.5
TIEREXPERIMENTELLE
METHODEN
.
32
2.5.1
TIERHALTUNG
.
32
2.5.2
HERSTELLUNG
TRANSGENER
TIERE
.
32
2.5.3
GEWEBEBIOPSIE
.
'.
.
32
2.5.4
INTRAPERITONEALE
INJEKTION
.
33
3
ERGEBNISSE
.
34
3.1
D
AS
M
X
-
H
F
AS
L-T
RANSGEN
.
34
3.1.1
SEQUENZSPEZIFISCHE
ANALYSE
DER
PROMOTORREGION
MIT
HILFE
DES
PROGRAMMS
MACVECTOR
.
35
3.2
E
TABLIERUNG
DER
M
X
-
H
F
AS
L
TRANSGENEN
M
AUSLINIEN
.
36
3.2.1
TRANSGENE
GRUENDERTIERE
UND
DIE
ERSTE
NACHKOMMENGENERATION
.
36
3.2.2
ETABLIERUNG
DER
LINIEN
TG
51,
TG
510
UND
TG
54
.
37
3.3
M
AEUSE
DER
L
INIE
T
G
51
ZEIGEN
EINEN
PATHOLOGISCHEN
P
HAENOTYP
.
38
3.4
T
RANSGENEXPRESSION
IN
DEN
L
INIEN
TO
51,
T
G
510
UND
T
G
54
.
42
3.4.1
HFASL-EXPRESSION
OHNE
BZW.
NACH
EINER
POLYL-POLYC-VERMITTELTEN
TRANSGENAKTIVIERUNG
.
42
3.4.1.1
NORTHERN-BLOT-ANALYSEN
.
43
3.4.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
TRANSGENEXPRESSION
MITTELS
RT-PCR
.
45
3.4.1.3
RNASE-PROTEKTIONSANALYSEN
.
.'47
3.4.1.4
LINIENSPEZIFISCHER
VERGLEICH
DER
HFASL-RNA-EXPRESSION
.
50
3.4.2
UNTERSUCHUNG
DER
HFASL-PROTEINEXPRESSION
IN
DEN
LINIEN
TG
51,
510
UND
54
.
53
3.4.2.1
ANALYSE
DER
PROTEINE
AUS
ORGANEN
IM
WESTERN-BLOT
.
53
3.4.2.2
IMMUNPRAEZIPITATION
DES
HFASL-PROTEINS
AUS
35
S-MARKIERTEN
ZELLEN
.
54
3.4.2.3
IMMUNPRAEZIPITATION
DES
HFASL-PROTEINS
AUS
ORGANEN
.
'
.
56
3.4.2.4
VERGLEICH
DER
HFASL-PROTEINEXPRESSION
IN
MAEUSEN
DER
LINIE
TG
51
.
59
3.5
D
AS
K
RANKHEITSBILD
IN
DER
L
INIE
T
G
51
IST
F
AS
-L/
FAS
-
R
ABHAENGIG
.
61
3.5.1
ANALYSE
DER
TRANSGEN-HETEROZYGOTEN
NACHKOMMEN
MIT
IPR-MUTATION.
61
3.5.2
ANALYSE
DER
TRANSGEN-HOMOZYGOTEN
NACHKOMMEN
MIT
IPR-MUTATION
.
63
3.6
A
NALYSEN
ZUR
P
ATHOGENESE
DER
FUER
DIE
TRANSGENE
M
AUSLINIE
T
G
51
SPEZIFISCHEN
ERKRANKUNG
.
65
3.6.1
KLINISCHE
BEOBACHTUNGEN
.
65
3.6.2
HISTOPATHOLOGISCHE
ASPEKTE
.
67
3.6.2.1
DIE
HISTOMORPHOLOGIE
IN
0,5-TAGE
ALTEN
MAEUSEN
IST
UNAUFFAELLIG
.
67
3.6.2.2
AM
TAG
3,5-4,5
PP
HABEN
DIE
TRANSGENEN
MAEUSE
INFILTRATE
IM
HAUTGEWEBE
.
67
3.6.2.3
VERSTAERKTE
INFILTRIERUNG
DES
SCHWANZGEWEBES
UND
NEKROSEN
AM
TAG
6,5-9,5
.
69
3.6.2.4
HOMOZYGOTE
TRANSGENE
TIERE
ZEIGEN
UBIQUITAER
EINE
STARKE
DERMALE
INFILTRIERUNG
.
70
3.6.2.5
ABSCHWAECHUNG
DER
INFILTRIERUNG
.
72
3.6.2.6
GERINGE
INFILTRIERUNG
DER
KOERPERHAUT
UND
DEMARKATION
DER
SCHWANZHAUT
.
73
3.6.2.7
DIE
HISTOMORPHOLOGIE
DER
MAEUSE
AB
TAG
42,5
PP
IST
UNAUFFAELLIG
.
75
3.6.3
ZELLTYP-SPEZIFISCHE
ANALYSE
DER
INFILTRATE
.
76
3.6.3.1
DIE
NEUTROPHILEN
GRANULOZYTEN
BILDEN
DEN
HAUPTBESTANDTEIL
DER
INFILTRATE
.
76
3.6.4
ANALYSE
ZUM
NACHWEIS
APOPTOTISCHER
ZELLEN
.
77
3.6.5
ZELLTYP-SPEZIFISCHE
ANALYSEN
DER
LEBER,
DER
MILZ
UND
DES
KNOCHENMARKS
.
79
3.6.5.1
EINE
HYPERPLASIE
DER
LY-6G-EXPRIMIERENDEN
ZELLPOPULATION
.
79
3.6.S.2
DIE
HYPERPLASIE
DER
LY-6G+
POPULATION
.
80
3.6.6
AUSWIRKUNGEN
EINER
INDUZIERTEN
HFASL-EXPRESSION
.
81
3.6.7
MOLEKULARE
ASPEKTE
ZUR
PATHOGENESE
DER
ERKRANKUNG
IN
DER
LINIE
TG
5
IC.
.
83
3.6.7.1
ANALYSE
EINER
ALTERSABHAENGIGEN
HFASL-EXPRESSION
.
83
3.6.7.2
UNTERSUCHUNG
DER
AKTIVIERUNG
VON
CASPASE-3
.
87
3.6.7.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
PROINFLAMMATORISCHER
ZYTOKINE
IN
DER
HAUT
.
89
4
DISKUSSION
_
_
94
4.1
E
XPRESSION
VON
H
F
AS
L
IN
DEN
L
INIEN
T
G
51,
T
G
510
UND
T
G
54
.
94
1.1.
1
DIE
TRANSKRIPTLAENGE
IST
IN
ALLEN
DREI
LINIEN
GLEICH
.
94
4.1.2
DIE
MAEUSE
DER
LINIEN
TG
51
UND
TG
510
WEISEN
IDENTISCHE
EXPRESSIONSMUSTER
AUF
DER
RNA-EBENE,
JEDOCH
NICHT
AUF
DER
PROTEINEBENE
AUF.
.
94
4.2
A
BHAENGIGKEIT
DER
E
RKRANKUNG
IN
DEN
T
G
51
-M
AEUSEN
VOM
F
AS
-R
EZEPTOR
.
95
4.3
D
ER
P
HAENOTYP
DER
TG
5
1
MAEUSE
IM
Z
USAMMENHANG
MIT
DER
PROINFLAMMATORISCHEN
FASL-WIRKUNG
.
96
4.3.1
SEKUNDAERE
PHAENOTYPISCHE
ASPEKTE
IM
KRANKHEITSBILD
DER
TG
51-MAEUSE
.
97
4.3.1.1
STEIGERUNG
DER
GRANULOPOESE
.
97
4.3.1.2
HAUTNEKROSEN
.
98
4.3.1.3
GEWICHTSSTAGNATIONEN
UND
FETTGEWEBENEKROSEN
.
98
4.3.1.4
ABFLACHUNG
DER
SKROTALEN
REGION
.
99
4.3.1.5
HYPERPROLIFERATION
DER
BASALEN
KERATINOZYTEN
.
99
4.3.1.6
STAMM-SPEZIFISCHE
UNTERSCHIEDE
IN
DER
AUSPRAEGUNG
DES
PATHOLOGISCHEN
.
100
4.4
P
ATHOGENESE
DER
E
RKRANKUNG
IN
DEN
T
G
51
-M
AEUSEN
.
100
4.4.1
ANALYSEN
EINER
ALTERSABHAENGIGEN
HFASL-EXPRESSION
.
100
4.4.2
LOKALISIERUNG
UND
ZUSAMMENSETZUNG
DER
INFILTRATE
.
101
4.4.3
MOLEKULARER
MECHANISMUS
DER
FASL-INDUZIERTEN
ENTZUENDUNG.
.
101
4.4.3.1
BEDEUTUNG
DER
IL-LSS-HOCHREGULATION
.
103
4.4.4
FAS
UND
IL-LRI-EXPRIMIERENDE
ZELLPOPULATIONEN
IN
MURINER
HAUT
UND
EIN
MODELL
ZUR
FASL-INDUZIERTEN
ERKRANKUNG
IN
DEN
TG
51-MAEUSEN
.
104
4.4.5
BEDEUTUNG
DER
CASPASE-3-AKTIVIERUNG
.
105
4.5
P
OLY
I-P
OLY
C
INDUZIERTE
H
F
AS
L-E
XPRESSION
IN
DEN
T
G
51
-MAEUSEN
.
106
4.6
V
ERIFIZIERUNG
DES
T
G
51
-P
HAENOTYPS
.
:.
.
107
4.7
P
OTENZIELLE
B
EDEUTUNG
EINER
DEREGULIERTEN
F
AS
L/F
AS
-
EXPRESSION
IN
PATHOPHYSIOLOGISCHEN
S
ITUATIONEN
.
107
4.8
T
G
51
-M
AEUSE
ALS
M
ODELLSYSTEM
.
108
5
LITERATURVERZEICHNIS
110
6
ANHANG
------------------------
121
6.1
V
ERGLEICH
DES
F
ASL
-L
ESERASTERS
IM
M
ENSCH
(1-843)
UND
M
AUS
(1-837)
.
121
6.2
D
AS
M
X
-F
AS
L-T
RANSGEN
.
122
6.2.1
DIE
DNA-SEQUENZ
DES
MX-FASL-KONSTRUKTES
.122
6.2.2
ANALYSE
DER
PROMOTORREGION
MIT
HILFE
DES
PROGRAMMS
MACFECTOR
6.5.3
.
126
6.3
HFASL-RNA-EXPRESSION
OHNE
BZW.
NACH
EINER
POLYL-POLYC-LNJEKTRON
.
127
6.4
W
ACHSTUMSPARAMETER
DER
T
G
51
C-M
AEUSE
.
127
6.4.1
GEWICHT
IN
GRAMM
.
127
6.4.2
GEWICHTSABWEICHUNGEN
(IN
%)
.
127
6.5
Z
ELLTYP
-
SPEZIFISCHE
A
NALYSEN
.
128
6.5.7
GESAMTZAHL
(XL(F)
DER
ISOLIERTEN
ZELLEN
.
128
6.5.2
LY-6G+
ZELLEN
(IN
%)
NACH
FACS
.
128
6.5.3
ABWEICHUNGEN
(
IN
%)
IN
DER
GROESSE
DER
LY-6G+
POPULATION
IN
TRANSGENEN
MAEUSEN
DER
LINIE
TG
51
IM
VERGLEICH
ZU
DEN
WT-GESCHWISTERTIEREN.
.
128
6.5.4
ANTEIL
ANDERER
ZELLPOPULATIONEN
(IN
%):
.128
6.5.5
LY-6G+
ZELLEN
IN
DEN
IPR/LPR-MAEUSEN
.128
6.5.6
ZELLPOPULATIONSANALYSEN
(FACS)
IN
DEN
POLYL-POLYC-INJIZIERTEN
MAEUSEN
.129
EIDESSTATTLICHE
ERKLAERUNG
.
X
WISSENSCHAFTLICHE
BEITRAEGE
.
XI
LEBENSLAUF.
.XII |
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