Biologische Charakterisierung der Rezeptoren für Transforming-Growth-Faktor-Beta:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German English |
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2001
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| Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2002 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALT
I. EINLEITUNG 1
1.1. TGF-SS UND DIE TGF-SS SUPERFAMILIE 2
I. 1.1. TGF-SS VERMITTELTE AKTIVITAETEN
2
I. 1.2. MITGLIEDER DER TGF-SS SUPERFAMILIE
3
1.1.2. PROZESSIERUNG DER LIGANDEN '
3
1.1.3. ZELLZYKLUSKONTROLLE DURCH TGF-SS
3
1.2. REZEPTOREN DER TGF-SS SUPERFAMILIE
4
1.2.1. STRUKTUR, AUFBAU UND FUNKTION DER REZEPTOREN
4
1.2.2. LIGANDENBINDUNG UND REZEPTORAKTIVIERUNG
5
1.2.3. REZEPTORASSOZIIERTE MOLEKUELE
7
1.2.4. WECHSELWIRKUNG DER REZEPTOREN MIT TAK1 UND TAB1
9
1.2.5. DOMINANT NEGATIVE WIRKUNGSWEISE VON VERKUERZTEN TGF-SS
10
TYP II REZEPTOREN (ACYT-MUTANTEN)
1.3. DIE SMAD-PROTEINE
12
1.3.1. SIGNALTRANSDUKTION DURCH SMAD-PROTEINE
12
1.3.2. STRUKTURELLE MERKMALE DER SMADS
14
1.3.3. SMAD-INTERAGIERENDE PROTEINE
1 G
1.3.3.1. SARA, EIN SMAD/REZEPTOR ANKER-PROTEIN 16
1.3.3.2. SMURF-PROTEINE
16
1.3.4. DNA-BINDUNGSPARTNER DER SMADS
17
1.3.5. TRANSKRIPTIONELLE CO-FAKTOREN DER SMAD-PROTEINE
19
1.3.5.
1. CO-AKTIVATOREN 19
1.3.5.2. CO-REPRESSOREN
19
1.3.6. SMAD-VERMITTELTER REZEPTOR ,CROSS-TALK'
20
A. BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DES TGF-SS TYP LL-B REZEPTORS:
A.I. EINLEITUNG 23
A.1.1. DIE DREI TGF-SS ISOFORMEN UND IHRE KNOCKOUTS 23
A.I.
2. REZEPTORVARIABILITAET UND SIGNALMODULATION 25
A.I.3. DIE TGF-SS TYP I REZEPTOREN: ALKS (ACTIVIN RECEPTOR LIKE KINASES)
27
A.I.4. BEDEUTUNG DER TYP III REZEPTOREN FUER DIE TGF-SS SIGNALUEBERTRAGUNG
29
A.I.4.1. TYP III REZEPTOREN FUER DIE TGF-SS BINDUNG: BETAGLYKAN UND
ENDOGLIN
29
A.L.4.2. BEDEUTUNG DES TSSRIII FUER DIE TGF-B2 BINDUNG
32
A.I.5. ISOLIERUNG DES TGF-SS TYP LL-B REZEPTORS 32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/964219697
INHALTSVERZEICHNIS
A.II. ERGEBNISSE 35
A.II.1. IDENTIFIZIERUNG EINER ALTERNATIV GESPLEISSTEN VARIANTE DES 35
TGF-SS TYP II REZEPTORS - TSSRII-B
A.II.2. ISOLATION DER TSSRII-B CDNA UND HERSTELLUNG VON TSSRII-B- 36
EXPRESSIONSPLASMIDEN
A.II.3. AUFKLAERUNG DER EXON-INTRON STRUKTUR DES
TSSRLL-B GENS 38
A.II.4. STUDIEN ZUM ISOFORMSPEZIFISCHEN BINDUNGSVERHALTEN VON TSSRII-B 39
A.II.5. STUDIEN ZUR BILDUNG VON OLIGOMEREN KOMPLEXEN MIT TSSRII-B 41
A.II.5.1. INTERAKTION DES TSSRII-B MIT DEM TGF-SS TYP I REZEPTOR FTSSRI)
41
A.U.5.2. INTERAKTION DES TSSRII-B MIT DEM TGF-SS TYP III REZEPTOR (TSSRIII)
41
A.LL.5.3. INTERAKTION DES TSSRII-B MIT DEM TGF-SS TYP II REZEPTOR 44
A.II.6. CHARAKTERISIERUNG DER TGF-B2 BINDUNG AN TSSRII-B 45
A.II.6.1. HERSTELLUNG VON TSSRII-B MUTANTEN
"R
45
A.11,6.2. BINDUNG VON TGF-B2 AN TSSRII-B-LNSERT-MUTANTEN
46
A.LL.6.3. VERSUCH ZUR BETEILIGUNG DER INSERT-SEQUENZ AN DER
LIGANDENBINDUNG 47
A.II.7. STUDIEN ZUR GEWEBESPEZIFISCHEN EXPRESSION VON TSSRII-B 49
A.II.8. STUDIEN ZUR SIGNALUEBERTRAGUNG DURCH TSSRII-B 53
A.II.6.1. TSSRII-B SIGNALUEBERTRAGUNG IN DR-26 ZELLEN
53
A.II.3.2. TYP III REZEPTOR UNABHAENGIGE TSSRII-B-SIGNALUEBERTRAGUNG
54
A.II.9. STUDIEN ZU INTERAKTION UND SIGNALTRANSDUKTION VON TSSRII-B 58
UND TYP I REZEPTOREN DER TGF-SS SUPERFAMILIE, DEN ALKS
(ACTIVIN RECEPTOR-LIKE KINASES)
A.II.9.1. BINDUNGSSTUDIE ZUR INTERAKTION VON TSSRII-B MIT ALKS
58
AI 1.9.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR SIGNALUEBERTRAGUNG VIA TSSRII-B/ALK-KOMPLEXE
59
A.LL.9.3. UNTERSUCHUNGEN ZUMPSBE-LUC-REPORTERGENKONSTRUKT 62
A.II.10. UNTERSUCHUNGEN ZUR SPEZIFITAET DOMINANT NEGATIVER 64
TGF-SS TYP II REZEPTOREN (ACYT-MUTANTEN)
A.11.10.1. HERSTELLUNG DER ACYT-KONSTRUKTE
64
ALL. 10.2. PROTEINEXPRESSION VON WILDTYPISCHEN UND TRUNKIERTEN TGF-SS
65
TYP II REZEPTOREN
ALL. 10.3. EXPRESSION VON TSSRII-B-ACYT-HA AN DER ZELLOBERFLAECHE UND
67
LIGANDENABHAENGIGE OLIGOMERISIERUNG
ALL. 10.4. REPORTERGEN MESSUNGEN ZUR DOMINANT NEGATIVEN WIRKUNG VON
68
TSSRII-ACYT UND TSSRII-B-ACYT-HA
INHALTSVERZEICHNIS
A.LLL. DISKUSSION 70
A.III.1. KLONIERUNG VON TSSRII-B UND ALTERNATIVES SPLEISSEN 70
A.III.2. LIGANDENBINDUNG UND KOMPLEXBILDUNG 71
A.III.2.1. LIGANDENBINDUNGSMODUS VON TSSRII-B
71
A.III.2.2. OLIGOMERISIERUNGSVERHALTEN VON TSSRII-B
73
A.III.3. ANALYSE DER TGF-B2 BINDUNG AN TSSRII-B 74
ALL 1.3.1. ALTERNATIVE LIGANDENBINDUNGSSTELLEN AM TYP LL-B REZEPTOR ?
74
A. II 1.3.2. ERKENNTNISGEWINNUNG DURCH STRUKTURANALYSE ?
76
A.III.4. BEDEUTUNG DER TSSRII-B EXPRESSION IN KNOCHENGEWEBEN 78
A.111.4.1. SPEZIFISCHE OBERFLAECHENEXPRESSION VON TSSRII-B
78
AI 11.4.2. DIE ROLLE VON TGF-SS IM KNOCHEN
80
A.III.5. SIGNALUEBERTRAGUNG VIA TSSRII-B 83
A.III.6. INTERAKTION VON TSSRII-B MIT TYP I REZEPTOREN DER TGF-B 85
FAMILIE
A.III.7. SPEZIFITAET DOMINANT NEGATIVER TYP II REZEPTOR MUTANTEN 88
B. CHARAKTERISIERUNG VON MUTATIONEN IN DER SIGNALPEPTIDSEQUENZ DES TGF-SS
TYP I REZEPTORS IN B-ZELLEN VON PATIENTEN MIT CHRONISCHER LYMPHATISCHER
LEUKAEMIE:
B.L. EINLEITUNG 91
B.I.1. DIE ROLLE VON TGF-SS BEI ENTSTEHUNG UND WACHSTUM VON TUMOREN 91
B.L. 1.1. AUTOKRINE WIRKUNG VON TGF-SS
91
B.L. 1.2. PARAKRINE WIRKUNG VON TGF-SS
92
B.L. 1.3. TUMORPROGRESSION DURCH SELEKTIVE SIGNALUEBERTRAGUNG
92
B.I.2. INAKTIVIERUNG VON KOMPONENTEN DER TGF-SS SIGNALKASKADE 93
/
WAEHREND DER TUMORGENESE
B.L.2.1. DEFEKTE DER TGF-SS REZEPTOREN BEI DER TUMORENTSTEHUNG 93
B.L.2.2. DEFEKTE DER SMAD-PROTEINE BEI DER TUMORENTSTEHUNG 95
B.I.3. CHRONISCHE LYMPHATISCHE LEUKAEMIE (B-CLL) 97
B.I.3.1. CHARAKTERISTISCHE MERKMALE DER ERKRANKUNG
97
B.L.3.2. VERLUST VON FUNKTIONALEM TSSRI AN DER ZELLOBERFLAECHE VON TGF-SS
98
RESISTENTEN B-ZELLEN BEI CHRONISCHER LYMPHATISCHER LEUKAEMIE
INHALTSVERZEICHNIS
B.LL. ERGEBNISSE 99
B.II.
1
. KLONIERUNG VON TSSRI UND TSSRII CDNAS MITTELS RT-PCR UND
99
DEREN SEQUENZIERUNG
B.II.
2
. HERSTELLUNG DES EUKARYOTISCHEN TBRI/A
8
EPRESSIONSPLASMIDES 100
B.II.3. UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION UND TRANSPORT VON T
8
RI/A
8
101
B.II.4. REPORTERGENSTUDIEN ZUR UNTERSUCHUNG DER SIGNAL- 103
UEBERTRAGUNGSAKTIVITAET VON T
8
RI/A
8
B.LLL. DISKUSSION 106
IV. MATERIAL UND METHODEN 113
IV.1. ABKUERZUNGEN
113
IV.2. ARBEITSMATERIALIEN H
5
IV.2.1. GERAETE
115
IV.2.2. CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN
11
G
IV.2.3. ZELLKULTURMATERIAL
11
G
IV.2.4. ZYTOKINE
117
IV.2.5. OLIGONUKLEOTIDE
117
IV.2.6. ENZYME
117
IV.2.7. ANTIKOERPER
117
IV.2.8. EXPRESSIONSVEKTOREN UND BAKTERIENSTAEMME
119
IV.2.9. ZELLINIEN
120
IV.3. LOESUNGEN UND PUFFER
121
IV.4. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 123
IV. 4.1. KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN
1
23
IV.4.2. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN DURCH HITZESCHOCK
123
IV.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN , 124
IV. 5.1. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIENKULTUREN
124
IV. 5.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN
1
25
IV.5.3. RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA
1
25
IV.5.4. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN
126
IV. 5.5. PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION VON NUKLEINSAEUREN
1
26
IV.5.6. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
126
IV.5.7. DNA-GROESSENSTANDARD
1
27
IV.5.8. REVERSE TRANSKRIPTION (RT)
127
IV.5.9. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
128
IV.5.10. SEQUENZIERUNG
129
INHALTSVERZEICHNIS
IV.6. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 130
IV.6.1. ZELLKULTUR
130
IV. 6.2. ZELLZAHLBESTIMMUNG
130
IV.6.3. TRANSFEKTIONSMETHODEN
130
IV.6.4. SS-GALACTOSIDASE-TEST
131
IV. 7. PROTEINCHEMISCHE UND IMMUNOLOGISCHE METHODEN 132
IV. 7.1. JODIERUNG VON TGF-SS
1
32
IV.7.2. CHEMISCHE QUERVERNETZUNG VON F
25!}TGFSS (CROSSLINKING)
132
IV.7.3. ZELLYSE
133
IV. 7.4. IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN
133
IV.7.5. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
134
IV.7.6. WESTERN-BLOT
135
IV.7.7. PROTEINGROESSENSTANDARD
136
IV.7.8. IN VIVO MARKIERUNG VON ZELLEN MIT F^S}CYSTEIN/METHEONIN
137
IV.7.9. BIOTINYLIERUNG VON OBERFLAECHENPROTEINEN
137
IV. 7.10. REPORTERGEN-ASSAY
138
V. ANHANG 140
VI. LITERATUR 142
VII. ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 163
SCHRIFTENVERZEICHNIS 167
LEBENSLAUF 168
DANKSAGUNG 169
EHRENWOERTLICHE ERKLAERUNG 170 |
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