Cytomegalievirus-Infektionen nach Organtransplantationen: molekulare Analysen der Variabilität des Glykoprotein-B-Gens
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2001
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2
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.
4
1.1 BEDEUTUNG DER CYTOMEGALIEVIRUS-INFEKTIONEN BEI ORGAN- UND
KNOCHENMARKTRANSPLANTATIONEN.4
1.1.1 METHODEN DER HCMV-DIAGNOSTIK ZUR VIROLOGISCHEN VERLAUFSKONTROLLE
NACH TRANSPLANTATIONEN.5
1.1.2 THERAPIE VON HCMV-INFEKTIONEN MIT ANTIVIRALEN SUBSTANZEN.9
1.2 DIE FAMILIE DER HERPESVIREN (HERPESVIRIDAE).10
1.2.1 HERPES SIMPLEX VIRUS TYP 1 UND TYP 2 (HHV-1 BZW. HHV-2).13
1.2.2 VARICELLA ZOSTER VIRUS (HHV-3).13
1.2.3 EPSTEIN-BARR-VIRUS (HHV-4).13
1.2.4 HUMANES HERPESVIRUS TYP 6 (HHV-6).'.13
1.2.5, HUMANES HERPESVIRUS TYP 7 (HHV-7).14
1.2.6 HUMANES HERPESVIRUS TYP 8 (HHV-8).15
1.2.7 DAS HUMANE CYTOMEGALIEVIRUS (HCMV BZW. HHV-5).15
1.2.7.1 ALLGEMEINES.
15
1.2.7.2 AUFBAU DES HCMV-GENOMS.17
1.2.7.3 DIE BEDEUTUNG DER HCMV-VARIANTEN FUER DIE PATHOGENITAET EINER
HCMV-INFEKTION.19
2 ZIELSETZUNG.21
3 MATERIAL UND METHODEN. .23
3.1 PATIENTENKOLLEKTIVE AUS DER TRANSPLANTATIONSMEDIZIN.23
3.1.1 KOLLEKTIV DER LEBERTRANSPLANTATIONSPATIENTEN.23
3.1.2 KOLLEKTIV DER KNOCHENMARKTRANSPLANTATIONSPATIENTEN.-.23
3.2 PROBENAUFARBEITUNG.24
3.3 VIRUSANZUCHT ZUR DNA-PRAEPARATION.25
3.4 POLYMERASEKETTENREAKTION.26
3.4.1 GLYKOPROTEIN B-PCR UND VERWENDETE PRIMER.26
3.4.2 TYPISIERUNG DES GB-GENS NACH CHOU ET AL.31
3.4.3 TYPISIERUNG DES GH-GENS NACH CHOU ET AL.33
3.5 EINZELSTRANG-KONFORMATIONS-POLYMORPHISMUS (SSCP)-ANALYSE.34
3.5.1 DURCHFUEHRUNG DER SSCP-AUALYSE.35
3.6 NICHT-RADIOAKTIVE SSCP-ANALYSE.36
3.6.1 VERWENDUNG BIOTINYLIERTER PRIMER UND STREPTAVIDIN-ALKALISCHE
PHOSPHATASE-KONJUGAT.36
3.6.1.1 DURCHFUEHRUNG DER SSCP-ANALYSE MIT BIOTINYLIERTEN PRIMERN UND
STREPTAVIDIN-ALKALISCHE
PHOSPHATASE-KONJUGAT.37
3.6.2 SILBERFAERBUNG VON SSCP-GELEN.38
3.7 DNA-SEQUENZIERUNG NACH DER METHODE VON SAENGER. .38
3.8 METHODEN ZUR GEWINNUNG EINZELSTRAENGIGER DNA FUER DIE SEQUENZIERUNG.39
3.8.1 VERWENDUNG PAERAMAGNETISCHER POLYSTYROLPARTIKEL (DYNABEADS).39
3.8.1.1 DURCHFUEHRUNG DER DNA-EINZELSTRANGTRENNUNG MIT DYNABEADS.40
3.8.2 DURCHFUEHRUNG EINER ASYMMETRISCHEN PCR.41
3.9 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MIT HILFE VON SILIKATPARTIKELN.41
3.9.1 DURCHFUEHRUNG DER PCR-PRODUKT-REINIGUNG MIT HILFE VON
SILIKATPARTIKELN.42
3.10 DNA-SEQUENZIERUNG UNTER VERWENDUNG VON SEQUENASE./.43
3.10.1 DURCHFUEHRUNG DER DNA-SEQUENZIERUNG MIT SEQUENASE.43
3.10.2 SEQUENZIERUNG VON PLASMIDEN.45
3.11 AUTOMATISCHE DNA-SEQUENZIERUNG.46
3.11.1 DURCHFUEHRUNG DER AUTOMATISCHEN DNA-SEQUENZIERUNG.46
3.12 EINBAU VON PCR-PRODUKTEN IN PLASMIDE UND ANSCHLIESSENDE
KLONIERUNG.47
3.12.1 DURCHFUEHRUNG DER KLONIERUNG.
49
3.12.2 PHENOLEXTRAKTION VON PLASMID-DNA.50
3.12.2.1 DURCHFUEHRUNG DER PHENOLEXTRAKTION VON PLASMID-DNA.50
3.12.3 MIDI-PLASMID PRAEPARATION MIT QIAGEN-SAEULEN.
51
3.12.3.1 DURCHFUEHRUNG PLASMID PRAEPARATION.51
3.13 ANHANG: VERWENDETE BIOCHEMIKALIEN, MATERIALIEN UND GERAETE.52
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3
4 ERGEBNISSE.54
4.1 GLYKOPROTEIN B-GEN DES CYTOMEGALIEVIRUS ALS DNA-TARGET FUER DIE
PCR.54
4.2 RFLP-ANALYSE VON GLYKOPROTEIN B-GENSEQUENZEN ZUR VARIANTENANALYSE.56
4.3 GLYKOPROTEIN H-GEN DES CYTOMEGALIEVIRUS ALS EIN WEITERES DNA-TARGET
FUER PCR UND RFLP.56
4.4 ANALYSE VON AMPLIFIKATIONSPRODUKTEN MITTELS SSCP.57
4.5 NICHT-RADIOAKTIVE SSCP-ANALYSEMETHODEN.64
4.6 SSCP-ANALYSE MIT ANSCHLIESSENDER SILBERFAERBUNG.65
4.7 SEQUENZIERUNG VON AMPLIFIKATIONSPRODUKTEN AUS DER NESTED PCR.66
4.7.1 OPTIMIERUNG DER SEQUENZIERUNG VON
GB3/GB4-AMPLIFIKAETIONSPRODUKTEN.66
4.7.2 EINBAU UND CHARAKTERISIERUNG VON AMPLIFIKATEN NACH KLONIERUNG IN
PLASMIDE.68
4.7.3 DNA-SEQUENZIERUNG MIT FLUORESZENZFARBSTOFF MARKIERTEN
TERMINATOREN.68
4.8 AUSWERTUNG GEFUNDENER HCMV-VARIANTEN IN PATIENTENKOLLEKTIVEN.70
4.8.1 VERTEILUNG DER HCMV-VARIANTEN IM LTX-PATIENTENKOLLEKTIV.72
4.8.2 VERTEILUNG DER HCMV-VARIANTEN IM KMT-PATIENTENKOLLEKTIV.76
5 DISKUSSION.79
5.1 ALLGEMEINE BEDEUTUNG DER GLYKOPROTEINE GB UND GH FUER DIE
HERPESVIRUSINFEKTION.79
5.2 IMMUNOLOGISCHE KONTROLLE DER HCMV-INFEKTION.82
5.2.1 ANTIKOERPERANTWORT. 82
5.2.2 T-ZELLANTWORT UND HLA-MOLEKUELE.84
5.2.3 ENTWICKLUNG VON HCMV-IMPFSTOFFEN.87
5.2.4 HCMV LATENZ.:.88
5.3 AMPLIFIKATION UND DIREKTE SEQUENZIERUNG SPEZIFISCHER
HCMV-GENABSCHNITTE.89
5.3.1 HCMV-PCR UND GB-TYPISIERUNG NACH CHOU.89
5.3.2 HCMV-PCR UND GH-TYPISIERUNG NACH CHOU.91
5.3.3 POLYMERASEKETTENREAKTION MIT SEQUENZSPEZIFISCHEN PRIMERN (SSP).92
5.4 SSCP-ANALYSE ZUR DIFFERENZIERUNG VON HCMV-VARIANTEN.93
5.5 VERGLEICH DER SSCP-ANALYSE MIT ANDEREN METHODEN ZUR HCMV
GB-TYPISIERUNG.95
5.5.1 DGGE-ANALYSE UND WEITERE AEHNLICHE UNTERSUCHUNGSMETHODEN.95
5.5.2 HETERODUPLEX-ANALYSE.96
5.6 NACHWEIS DER AKTIVEN VIRUSINFEKTION UND BESTIMMUNG DER VIRUSLAST. 97
5.7 AUSWERTUNG DER GB-/GH-TYPISIERUNG VERSCHIEDENER
PATIENTENKOLLEKTIVE.97
5.7.1 AUSWERTUNG DER GB-/GH-TYPISIERUNG VON LTX-PATIENTEN.98
5.7.2 AUSWERTUNG DER GB-TYPISIERUNG VON KMT-PATIENTEN.99
5.7.3 AUSWERTUNG DER GB-TYPISIERUNG IN WEITEREN IMMUNDEFIZIENTEN
PATIENTENKOLLEKTIVEN.100
6 ZUSAMMENFASSUNG.104
7 LITERATURVERZEICHNIS.109
8 ABKUERZUNGEN.127
8.1 NUKLEINSAEUREBAUSTEINE
(IUPAC NUCLEOTIDE CODE).Y.133
8.2 AMINOSAEUREN. 134
9 DANKSAGUNG.135
10 LEBENSLAUF.136
11 EIGENE VEROEFFENTLICHUNGEN.137
12 ERKLAERUNG AN EIDES STATT.141 |
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