Endothelzellen und Fibrin: ein Modell zum Verständnis der Endothelzellbiologie beim akuten thrombotischen Gefäßverschluß
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1.1 PHYSIOLOGISCHE ROLLE DER ENDOTHELZELLEN. 1
1.2 BEDEUTUNG DER ENDOTHELZELLKULTUR. 4
1.3. PROBLEMSTELLUNG. 5
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 ZELLKULTUR. 9
2.1.1. ENDOTHELZELLISOLIERUNG UND -KULTIVIERUNG. 9
2.1.2. KULTIVIERUNG VON HUVEC IN GLASROEHRCHEN. 11
2.1.3. AUSSAAT VON ENDOTHELZELLEN IN 96 MULTIWELLS. 11
2.2. THROMBOZYTENISOLIERUNG. 11
2.3. ELISA. 13
2.3.1. PAI-1-ELISA. 13
2.3.1.1. PAI-1 BESTIMMUNG IN KULTURUEBERSTAENDEN. 13
2.3.1.2. PAI-1 BESTIMMUNG IN LYSATEN.^. 13
2.3.2. BESTIMMUNG DER PAI-1 AKTIVITAET. 14
2.3.3. T-PA- ELISA. 14
2.4. MODELLE ZUR FIBRINOLYSEMESSUNG. 15
2.4.1. "KUENSTLICHES GEFAESS" (ROEHRCHENMODELL). 15
2.4.1.1. PRINZIP DES LASER-LIGHT-SCATTERING. 15
2.4.1.2. MODELL-THROMBUS IM KUENSTLICHEN GEFAESS. 16
2.4.2. MULTIWELL - SYSTEM. 16
2.5. ELEKTRONENMIKROSKOPIE. 17
2.5.1. TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE. 17
2.5.2. RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE. 19
2.6. EXPRESSIONSSTUDIEN VON PAI-1 UND VITRONECTIN AN HUVEC UND HEPG2. 19
2.6.1. RT-PCR. 19
2.6.2. PCR-ELISA.:. 21
2.7. LASERSCANMIKROSKOPIE. 21
3. ERGEBNISSE
3.1. UNTERSUCHUNG DER SEKRETION FIBRINOLYTISCH RELEVANTER MOLEKUELE DURCH
KULTIVIERTE ENDOTHELIALE ZELLEN ANHAND VON ZELLKULTURUEBERSTAENDEN. 23
3.1.1. SEKRETION VON T-PA UND PAI-1 IN HUVEC, HUAEC UND HASVEC. 23
3.1.1.1. BASALE SEKRETION VON T-PA. 23
3.1.1.2. BASALE SEKRETION VON PAI-1. 24
3.1.2. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON TNF-A AUF DIE SEKRETION
VON T-PA UND PAI-1. 24
3.12.1. TNF-A UND T-PA-SEKRETION. 24
3.1.2.2. TNF-A UND PAI-1-SEKRETION. 25
3.1.3. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON TGF-SS AUF DIE SEKRETION
VON T-PA UND PAI-1. 26
3.1.3.1. TGF-SS UND T-PA-SEKRETION. 26
3.1.3.2. TGF-SS UND PAI-1-SEKRETION. 27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
3.1.4. EINFLUSS VON PHORBOL MYRISTATE-ACETATE (PMA) AUF DIE PRODUKTION
VON T-PA UND PAI-1 IN VERSCHIEDENEN ENDOTHELZELLEN. 28
3.1.4.1. EINFLUSS VON PMA AUF DIE SEKRETION VON T-PA. 28
3.1.4.2. EINFLUSS VON PMA AUF DIE SEKRETION VON PAI-1. 28
3.2. UNTERSUCHUNGEN ZUM EINFLUSS VON ENDOTHELZELLEN AUF EINEN
IN VITRO THROMBUS. 29
3.2.1. EINFLUSS DES ENDOTHELZELLUEBERSTANDES AUF DIE LYSE EINES
IN VITRO THROMBUS. 29
3.2.1.1. EINFLUSS DES KULTURUEBERSTANDES TNF-A-STIMULIERTER HUVEC AUF DIE
T-PA INDUZIERTE LYSE EINES
IN VITRO THROMBUS. 29
3.2.1.2. KORRELATION VON LYSEZEITEN UND PAI-1-KONZENTRATIONEN
IM ZELLKULTURUEBERSTAND. 31
3.2.1.3. WIRKUNG EINES PAI-1-INHIBIERENDEN ANTIKOERPERS AUF DIE
FIBRINOLYSE IN
ANWESENHEIT DES KULTURUEBERSTANDES TNF-A-STIMULIERTER ENDOTHELZELLEN. 32
3.2.2. EINFLUSS DER SEKRETIONSPRODUKTE VITALER ENDOTHELZELLEN (HUVEC)
AUF DIE LYSE EINES IN VITRO THROMBUS. 34
3.2.2.1. AKTIVIERTE ENDOTHELZELLEN VERZOEGERN DIE T-PA INDUZIERTE LYSE
VON FIBRINTHROMBEN. 34
3.2.22. DIE THROMBOLYTISCHE RESISTENZ EINES IN VITRO THROMBUS IST
ABHAENGIG VON DER DAUER DER ENDOTHELPRAESENZ. 36
3.2.2.3. UNTERSUCHUNGEN ZUR INKORPORATION DES VON ENDOTHELZELLEN
SEZEMIERTEN
(AKTIVEN) PAI-1 IN DAS FIBRINGERINNSEL. 38
3.2.3. ZEITABHAENGIGE THROMBOLYTISCHE RESISTENZ - KOOPERATION VON
BLUTPLAETTCHEN UND ENDOTHELZELLEN. 40
3.2.3.1. UNTERSUCHUNGEN ZUR ZEITABHAENGIGEN BEEINFLUSSUNG DER T-PA
INDUZIERTEN FIBRINOLYSE DURCH THROMBOZYTEN. 40
3.2.3.2. DIE ROLLE VON PAI-1 BEI DER PLAETTCHENINDUZIERTEN
THROMBOLYTISCHEN
RESISTENZ. 41
3.2.3.3. UNTERSUCHUNG DER GEGENSEITIGEN BEEINFLUSSUNG VON ENDOTHELZELLEN
UND
BLUTPLAETTCHEN IN DER VERMITTLUNG DER THROMBOLYTISCHEN RESISTENZ. 42
3.3. VERGLEICH VERSCHIEDENER ENDOTHELZELLTYPEN IM HINBLICK AUF IHRE PRO-
UND
ANTIFIBRINOLYTISCHE KAPAZITAET. 45
3.3.1. EINFLUSS VERSCHIEDENER UNSTIMULIERTER ENDOTHELZELLTYPEN AUF DIE
T-PA
INDUZIERTE FIBRINOLYSE. 46
3.3.2. EINFLUSS VON TNF-A AUF DIE FIBRINOLYTISCHE AKTIVITAET VERSCHIEDENER
ENDOTHELZELLTYPEN. 48
3.3.3. EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE FIBRINOLYTISCHE FUNKTION VERSCHIEDENER
ENDOTHELZELLTYPEN. 50
3.3.4. EINFLUSS VON PMA/FORSKOLIN AUF VERSCHIEDENE ENDOTHELZELLTYPEN. 52
3.3.5. PAI-1 UND T-PA KONZENTRATIONEN IN DEN LYSATEN DER MULTI
WELL-VERSUCHE. 53
3.3.5.1. T-PA KONZENTRATIONEN IN LYSEUEBERSTAENDEN. 53
3.3.5.2. PAI-1 KONZENTRATIONEN IN LYSEUEBERSTAENDEN. 54
3.3.5.3. T-P A/P AI-1 KOEFFIZIENT UND FIBRINOLYSE. 55
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.4. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHE STUDIEN AN ENDOTHELZELLEN
UND IM THROMBUS. 56
3.4.1. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON
ENDOTHELZELLEN. 56
3.4.1.1. NACHWEIS VON ULEX EUROPAEUES AGGLUTININ AUF ENDOTHELZELLEN. 56
3.4.1.2. NACHWEIS VON VWF IN ENDOTHELZELLEN. 57
3.4.2. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEIS VON'T-PA UND PAI-1. 58
3.4.2.1. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEIS VON T-PA IN HUVEC. 58
3.4.2.2. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEIS VON PAI-1 IN HUVEC. 59
3.4.3. SEMIQUANTITATIVE AUSWERTUNG DER IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHEN
MARKIERUNG FUER T-PA UND PAI-1 AN VERSCHIEDENEN ENDOTHELZELLEN
IN VIVO
UND IN VITRO. 59
3.4.3.1. VERGLEICH DER T-PA MARKIERUNG IN HUVEC, KAPILLAEREN, ARTERIELLEN
UND
GLOMERULAEREN ENDOTHELZELLEN.?. 59
3.4.3.2. VERGLEICH DER PAI-1-MARKIERUNG IN HUVEC, KAPILLAEREN,
ARTERIELLEN UND
GLOMERULAEREN ENDOTHELZELLEN. 60
3.4.4. IMMUNLOKALISATION UND VERTEILUNG VON PAI-1 IM FIBRIN-CLOT. 61
3.4.4.1. IMMUNLOKALISATION VON PAI-1 IM IN VITRO THROMBUS. 61
3.4.4.2. RELATIVE VERTEILUNG VON PAI-1 IM VON ENDOTHELZELLEN UMGEBENEN
IN VITRO
THROMBUS. 62
3.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR SEKRETIONSDYNAMIK
VON PAI-1 UND VITRONECTIN IN HUVEC UND HEPG2. 64
3.5.1. NACHWEIS DER MRNA-SYNTHESE VON VITRONECTIN UND PAI-1 IN ENDOTHEL-
UND LEBERZELLEN.). 64
3.5.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR ABHAENGIGKEIT DER VITRONECTINEXPRESSION VON
VORBESCHICHTUNG BZW. ANWESENHEIT VON VITRONECTIN IM MEDIUM. 66
3.5.3. UNTERSUCHUNGEN ZUR EINFLUSSNAHME DER ZYTOKINE TNF-A UND TGF-SS
AUF DIE VITRONECTIN UND PAI-1 EXPRESSION IN HUVEC. 67
3.5.3.1. EINFLUSS VON TNF-A AUF DIE VITRONECTIN- UND PAI- 1/EXPRESSION
IN HUVEC. 67
3.5.3.2. EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE VITRONECTIN- UND PAI-1 -EXPRESSION
IN HUVEC. 68
3.5.4. UNTERSUCHUNGEN ZUR EINFLUSSNAHME DER ZYTOKINE TNF-A UND TGF-SS AUF
DIE VITRONECTIN UND PAI-1 EXPRESSION IN HEPG2. 70
3.5.4.1. EINFLUSS VON TNF-A AUF DIE VITRONECTIN- UND PAI-1-EXPRESSION
IN HEPG2. 70
3.5.4.2. EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE VITRONECTIN- UND PAI-1-EXPRESSION
IN HEPG2. 71
INHALTSVERZEICHNIS RV
3.6. MORPHOLOGISCHE ANALYSE VON ENDOTHELZELLEN IM KONFOKALEN
LASER-SCAN MIKROSKOP. 72
3.6.1. DARSTELLUNG DER INTEGRINE A
VSS3 UND A5 SS, AUF ENDOTHELZELLEN. 72
3.6.1.1. INTEGRINVERTEILUNG IN ABHAENGIGKEIT VON DER VORBESCHICHTUNG
DURCH
DIE MATRIXMOLEKUELE FIBRO- UND VITRONECTIN. 72
3.6.1.2. AENDERUNGEN DER INTEGRINVERTEILUNG NACH STIMULATION MIT
PHORBOL-MYRISTATE ACETATE (PMA). 74
3.6.2. MORPHOLOGISCHE VERAENDERUNGEN DER ENDOTHELZELLEN IN KONTAKT ZU
FIBRIN. 80
3.6.2.1. ENDOTHEL-FIBRIN INTERAKTION NACH "WOUNDING" IN ANWESENHEIT
INTEGRIN-INHIBIERENDER OLIGOPEPTIDE. 80
3.6.2.2. SELEKTIVE BLOCKADE DER ENDOTHEL-FIBRIN INTERAKTION DURCH
VERSCHIEDENE OLIGOPEPTIDE. 82
3.6.2.3. FUNKTIONELLE KONSEQUENZEN DER FIBRIN-ENDOTHEL-INTERAKTION. 83
4. DISKUSSION. 85
5. ZUSAMMENFASSUNG. 105
6. LITERATURVERZEICHNIS. 107
7. ANHANG / PROTOKOLLE
7.1. IN DER ZELLKULTUR VERWENDETE CHEMIKALIEN UND ZYTOKINE. 121
7.2. LISTE DER VERWENDETEN ANTIKOERPER. 121
7.3. HEPES-GEY'S-ALBUMIN PUFFER. 122
7.4. ACD-PUFFER. 122
7.5. PLAETTCHENKONZENTRATIONSPUFFER (PLCON).! 122
7.6. PRAEPARATION VON FIBRINOGEN/PLASMINOGEN. 122
7.7. PROTOKOLL FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE. 123
7.8. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE. 124
7.8.1. PRE-EMBEDDING. 124
7.8.2. POST-EMBEDDING: TIEFTEMPERATUREINBETTUNG MIT LOWICRYL K4M. 125
7.8.3. IMMUNOGOLDMARKIERUNG DES IN VITRO THROMBUS. 126
7.9. LISTE DER VERWENDETEN ABKUERZUNGEN. 127
8. DANKSAGUNG
129 |
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