Untersuchungen zur Platin-DNA-Adduktbildung mittels Kapilarelektrophorese: Möglichkeiten und Grenzen
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Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
2001
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Schriftenreihe: | Berichte aus der Pharmazie
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PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG MITTELS KAPILLARELEKTROPHORESE MOEGLICHKEITEN
UND GRENZEN D 188 (DISS. FREIE UNIVERSITAET BERLIN) SHAKER VERLAG AACHEN
2001 INHALT INHALT 1 EINLEITUNG _ 3 1.1 KAPILLARELEKTROPHORESE 3 1.1.1
AUFBAU EINES CE-SYSTEMS 4 1.1.2 PRINZIPIEN DER KAPILLARELEKTROPHORESE 5
1.1.2.1 ELEKTROPHORESE 5 1.1.2.2 ELEKTROENDOSMOTISCHER FLUSS 7 1.1.2.3
EFFIZIENZ UND PEAKAUFIOESUNG 9 1.2 THERAPIE MALIGNER TUMOREN MIT
PLATINKOMPLEXEN 12 1.2.1 MALIGNE TUMOREN 12 1.2.2 PLATINKOMPLEXE IN
DER ONKOLOGIE 13 1.3 ANALYTIK VON PLATIN-DNA-ADDUKTEN 21 1.4
SURROGATFUNKTION PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG 23 1.5 BESONDERE STRATEGIEN
FUER DIE THERAPIE MIT PLATINKOMPLEXEN 23 1.6 PROBLEMSTELLUNG UND
ZIELSETZUNG 27 2 MATERIAL UND METHODEN 31 2.1 MATERIALIEN 31 2.1.1
CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 31 2.1.2 VERWENDETE LOESUNGEN UND PUFFER 32
2.1.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 34 2.1.4 GERAETE 35 2.2
KAPILLARELEKTROPHORESE 36 2.2.1 ENTWICKLUNG EINES CZE-TRENNSYSTEMS 36
2.2.1.1 MESSPRINZIP 36 2.2.1.2 TRENNSYSTEM UND DETEKTION 36 2.2.1.3
METHODENENTWICKLUNG UND-OPTIMIERUNG 37 2.2.2 VALIDIERUNG 42 2.2.2.1
SPEZIFITAET 42 2.2.2.2 MESSBEREICH, LINEARITAET 42 2.2.2.3 STABILITAET 43
INHALT 2.2.2.4 BESTIMMUNGS- UND NACHWEISGRENZE 43 2.2.2.5 RICHTIGKEIT
UND PRAEZISION 43 2.2.2.6 QUALITAETS-KONTROLL-PROBEN (QUALTTY CONTROL
SAMPLES) AA 2.2.2.7 KALIBRIERUNG - 45 2.2.2.8 KONZENTRATIONSBERECHNUNG
45 2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR ADDUKTBILDUNG MIT MONONUKLEOTIDEN 46 2.3.1
CZE-UNTERSUCHUNGEN MIT STANDARDNUKLEOTIDEN 46 2.3.1.1 INKUBATIONEN MIT
CISPLATIN, CARBOPLATIN, OXALIPLATIN UND LOBAPLATIN 46 2.3.2
CE/MS-KOPPLUNG 47 2.3.2.1 AUFKLAERUNG DER ADDUKTIDENTITAET 48 2.3.2.2
SPEZIELLE UNTERSUCHUNG DER 6-O-N(7)-CHELATBILDUNG 50 2.4
UNTERSUCHUNGEN ZUR ADDUKTBILDUNG MIT DNA 52 2.4.1 UNTERSUCHUNGEN MIT
KALBSTHYMUS-DNA 52 2.4.2 ISOLIERUNG DER LEUKOZYTEN 53 2.4.3
UNTERSUCHUNGEN MIT LEUKOZYTEN UND TUMORZELLEN 53 2.4.3.1 INKUBATION VON
LEUKOZYTEN MIT CISPLATIN 53 2.4.3.2 INKUBATION VON TUMORZELL-UENIEN MIT
CISPLATIN 54 2.4.4 DNA-ISOLIERUNG AUS LEUKOZYTEN UND TUMORZELLEN 55
2.4.5 BESTIMMUNG DES DNA-GEHALTES 55 2.4.6 ENZYMATISCHER ABBAU
ISOLIERTER DNA 56 2.4.7 CE MIT VERDAUTER DNA 57 2.4.8 QUANTIFIZIERUNG
DER PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG MITTELS ELISA 57 2.5 UNTERSUCHUNGEN MIT
PLATIN-ALBUMIN-KONJUGATEN 59 3 ERGEBNISSE 65 3.1 ENTWICKLUNG UND
OPTIMIERUNG EINER CZE-BESTIMMUNGSMETHODE 65 3.1.1 EXPERIMENTELLE
BESTIMMUNG DER MOBILITAET VON DESOXYMONONUKLEOTIDEN 65 3.1.2 BERECHNUNG
DER NETTOLADUNG 66 3.1.3 BERECHNUNG DES QUOTIENTEN AUS NETTOLADUNG UND
MASSE 67 3.1.4 KORRELATION DER MODELLVORHERSAGEN MIT DEN EXPERIMENTELL
BESTIMMTEN MOBILITAETSWERTEN 69 3.1.5 EINFLUSS DER KONZENTRATION DES
TRENNELEKTROLYTEN 69 3.1.6 EINFLUSS VON TRENNSPANNUNG UND TEMPERATUR 71
3.1.7 ZUSAMMENFASSUNG 73 INHALT 3.2 VORSTUDIENVALIDIERUNG 74 3.2.1
SPEZIFITAET 74 3.2.2 MESSBEREICH UND LINEARITAET 75 3.2.3 STABILITAET ~ 76
3.2.4 BESTIMMUNGS- UND NACHWEISGRENZE 78 3.2.5 RICHTIGKEIT UND PRAEZISION
78 3.3 CZE-UNTERSUCHUNGEN ZUR ADDUKTBILDUNG VON PLATINKOMPLEXEN 80 3.3.1
INKUBATION VON NUKLEOTIDEN MIT CISPLATIN 80 3.3.1.1 ELEKTROPHEROGRAMME
80 3.3.1.2 ABNAHMEKINETIK DER MONONUKLEOTIDE 82 3.3.1.3
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DER ADDUKTBILDUNG 84 3.3.1.4
CHARAKTERISIERUNG DER ADDUKTMUSTER 85 3.3.1.5 EINFLUSS DER
CHLORIDIONEN-KONZENTRATION 87 3.3.1.6 BESTIMMUNG DER
ABSORPTIONSQUOTIENTEN A 2M /A 2 6O 88 3.3.1.7 UNTERSUCHUNG DER
ADDUKTBILDUNG MITTELS DIODEN-ARRAY-DETEKTION (DAD) 89 3.3.2 INKUBATION
VON NUKLEOTIDEN MIT CARBOPLATIN 91 3.3.3 INKUBATION VON NUKLEOTIDEN MIT
OXALIPLATIN UND LOBAPLATIN 94 3.4 IDENTIFIZIERUNG DER
PLATIN-NUKLEOTID-ADDUKTE MITTELS CZE/ESI-MS-KOPPLUNG 97 3.4.1
CISPLATIN-ADDUKTE 97 3.4.2 6-O-N(7)-CHELATBILDUNG 101 3.4.3 ADDUKTE
WEITERER PLATINKOMPLEXE 106 3.4.3.1 CARBOPLATIN 106 3.4.3.2 OXALIPLATIN
UND LOBAPLATIN 107 3.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR ADDUKTBILDUNGSKINETIK 108
3.5.1 KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN DER CISPLATIN-ADDUKTBILDUNG MIT DGMP 109
3.5.2 KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN DER CISPLATIN-ADDUKTBILDUNG MIT DAMP 109
3.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR ADDUKTBILDUNG MIT DNA 110 3.6.1
CZE-UNTERSUCHUNGEN ZUR PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG MIT KALBSTHYMUS-DNA 110
3.6.2 QUANTIFIZIERUNG DER PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG IN TUMORZELLEN
MITTELS ELISA 112 3.6.3 QUANTIFIZIERUNG DER PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG IN
LEUKOZYTEN MITTELS ELISA 113 3.6.4 CZE-UNTERSUCHUNGEN DER
PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG IN TUMORZELLEN 114 3.6.5 CZE-UNTERSUCHUNGEN DER
PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG IN LEUKOZYTEN 115 3.7 ANWENDUNG DER CZE-METHODE
ZUR UNTERSUCHUNG DER ADDUKTBILDUNG VON PLATIN- ALBUMIN-KONJUGATEN 115
INHALT 3.7.1 REAKTIVITAET DER PLATIN-KONJUGATE A-PLAT IX UND A-PLAT X 116
3.7.1.1 INKUBATIONEN IN NEUTRALEM PH-MILIEU 116 3.7.1.2 INKUBATIONEN IN
SAURER UMGEBUNG 116 3.7.1.3 INKUBATIONEN IN NEUTRALEM PH-MILIEU NACH
VORANGEGANGENER SAURER SPALTUNG 116 3.7.1.4 UNTERSUCHUNG DER BINDUNG AN
ALBUMIN 117 3.7.2 REAKTIVITAET AKTIVER TEILSTRUKTUREN VON (POTENZIELLEN)
PLATIN-KONJUGATEN 118 4 DISKUSSION 123 4.1 KAPILLARZONENELEKTROPHORESE
123 4.1.1 BESTIMMUNGSMETHODE 123 4.1.2 ADDUKTBILDUNG VERSCHIEDENER
PLATINKOMPLEXE : 124 4.1.3 AENDERUNGEN DER UV-ABSORPTION DURCH DIE
BILDUNG VON ADDUKTEN 127 4.2 ADDUKTIDENTIFIZIERUNG MITTELS
CZE/ESI-MS-KOPPLUNG 129 4.3 QUANTIFIZIERUNG DER ZELLULAEREN
PLATIN-DNA-ADDUKTBILDUNG 133 4.4 ANWENDUNG DER CZE-METHODE IM RAHMEN VON
SCREENING-UNTERSUCHUNGEN MIT PLATIN-ALBUMIN-KONJUGATEN 137 4.5
PERSPEKTIVEN 139 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATUR 149
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