Funktionelle Charakterisierung des Imports des ADP-ATP-Carriers über die TIM22-Translokase der mitochondrialen Innenmembran:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 STRUKTUR UND FUNKTION DER MITOCHONDRIEN 3
1.1.1 MITOCHONDRIALE PROTEINE 4
1.2 MITOCHONDRIALE TRANSPORTERPROTEINE
5
1.2.1 DIE FAMILIE DER MITOCHONDRIALEN CARRIER 5
1.2.2 DER ADP/ATP-CARRIER 7
1.3 PROTEINIMPORT IN MITOCHONDRIEN 9
1.3.1 N-TERMINALE UND C-TERMINALE IMPORTSIGNALE 13
1.3.2 INTERNE IMPORTSIGNALE 14
1.3.3 PROTEINIMPORT UEBER DIE MITOCHONDRIALE AUSSENMEMBRAN 16
1.3.4 IMPORT UEBER DIE MITOCHONDRIALE INNENMEMBRAN DURCH DIE TIM23- 17
TRANSLOKASE
1.3.5 DIE TRANSLOKATIONSMASCHINERIE MITOCHONDRIALER 20
SUBSTRATRANSPORTERPROTEINE DER INNENMEMBRAN
1.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 23
2. MATERIAL UND METHODEN 24
2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 24
2.1.1 PRAEPARATION VON DNA 24
2.1.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI 24
2.1.1.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS S. CEREVISIAE 25
2.1.1.3 AMPLIFIZIERUNG VON DNA MITTELS DER POLYMERASE-KETTENREAKTION 26
(PCR)
2.1.2 ENZYMATISCHE MODIFIKATIONEN VON DNA 27
2.1.2.1 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.1.2.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT ALKALISCHER
PHOSPHATASE
2.1.2.3 AUFFUELLEN UEBERHAENGENDER DNA-ENDEN MIT DEM KLENOW-ENZYM
2.1.2.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-LIGASE
2.1.3 REINIGUNG UND ANALYSE VON DNA
2.1.3.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER DNA
2.1.3.2 PHENOLEXTRAKTION UND ETHANOLFAELLUNG
2.1.3.3 GELELEKTROPHORESE VON DNA
2.1.3.4 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN
2.1.3.5 ISOLIERUNG VON DNA AUS POLYACRYLAMIDGELEN
2.1.4 TRANSFORMATION VON E. COLI MIT PLASMID-DNA
2.1.5 VERWENDETE PLASMIDE
2.1.6 KLONIERUNGSSTRATEGIEN
2.2 HEFEGENETISCHE METHODEN
2.2.1 VERWENDETE STAEMME VON S. CEREVISIAE
2.2.2 KULTIVIERUNG VON S. CEREVISIAE
2.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
2.3.1 ISOLIERUNG VON MITOCHONDRIEN AUS S. CEREVISIAE
2.3. 2 ISOLIERUNG VON [
35S]-MARKIERTEN HEFEMITOCHONDRIEN
2.3.3 IN VHRO-PROTEINIMPORT IN ISOLIERTE MITOCHONDRIEN
2.3.4 PROTEASEVERDAU VON NICHTIMPORTIERTEN VORSTUFENPROTEINEN UND
IMPORT-INTERMEDIATEN
2.3.5 CHASE VON IMPORT-INTERMEDIATEN
2.3.6 SUBMITOCHODRIALE LOKALISIERUNG VON PROTEINEN
2.3.7 CARBONATEXTRAKTION
2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
2.4.1 PROTEINANALYTISCHE METHODEN
2.4.1.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION
2.4.1.2 FAELLUNG VON PROTEINEN MIT TRICHLORESSIGSAEURE (TCA)
2.4.1.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
2.4.1.4 TRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSE (WESTERN-BLOT)
2.4.1.5 AUTORADIOGRAPHIE UND DENSITOMETRIE
2.4.2 PRAEPARATION VON PROTEINEN 51
2.4.2.1 SYNTHESE MITOCHONDRIALER VORSTUFENPROTEINE IN VITRO 51
2.4.2.2 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI 52
2.4.2.3 REINIGUNG VON PROTEINEN MIT HIS-TAG UEBER NI-NTA 53
2.4.2.4 REINIGUNG VON MBP-FUSIONSPROTEINEN UEBER AMYLOSEHARZ 54
2.4.2.5 BESTIMMUNG DES ZINKGEHALTS DER REKOMBINANTEN PROTEINE 56
2.4.3 GELFILTRATION 56
2.4.4 BLAUE NATIVGELELEKTROPHORESE 57
2.4.5 CHEMISCHE QUERVEMETZUNG MITOCHONDRIALER PROTEINE 59
2.5 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 60
2.5.1 KOPPLUNG SYNTHETISCHER PEPTIDE AN OVALBUMIN ODER KLH 60
2.5.2 GEWINNUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 61
2.5.3 AFFINITAETSREINIGUNG VON ANTIKOERPERN 62
2.5.4 IMMUNFAELLUNGEN 64
2.5.5 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS IMMOBILISIERTER PROTEINE AUF 65
NITROZELLULOSE-MEMBRANEN
2.6 MATERIALIEN 66
2.6.1 VERWENDETE STAEMME VON E. COLI 66
2.6.2 HAEUFIG VERWENDETE MEDIEN UND PUFFER 67
2.6.3 CHEMIKALIEN UND ENZYME 68
2.6.4 LABORGERAETE 70
3. ERGEBNISSE 72
3.1 ROLLE VON TIM9, TIMLO UND TIML2 BEIM IMPORT VON PROTEINEN 72
MIT INTERNEM SORTIERUNGSSIGNAL IN DIE INNENMEMBRAN
3.1.1 TIM9, TIMLO UND TIML2 72
3.1.2 MEMBRANASSOZIATION VON TIM9, TIMLO UND TIML2 73
3.1.3 INTERAKTION VON TIM9, TIMLO, TIML2 MIT DER TIM22-TRANSLOKASE 75
3.1.4 ROLLE VON TIM9, TIMLO UND TIML2 BEIM PROTEINIMPORT 79
3.1.4.1 IMPORT VON PROTEINEN MIT N-TERMINALER PRAESEQUENZ IM VERGLEICH 82
ZU PROTEINEN MIT INTERNEM SORTIERUNGSSIGNAL
3.1.4.2 ROLLE VON TIM9 BEIM IMPORT DES AAC 83
3.1.5 TIM 10 UND TIM 12 SIND ZINKFINGERAEHNLICHE PROTEINE 84
3.1.5.1 EXPRESSION DER FUSIONSPROTEINE MBP-A-UNTEREINHEIT DER SS- 85
GALAKTOSIDASE, MBP-TIMLO UND MBP-TIML2
3.1.5.2 MBP-A-UNTEREINHEIT DER SS-GALAKTOSIDASE, MBP-TIMLO UND 86
MBP-TIML2 SIND ZINKBINDENDE PROTEINE
3.2 IMPORT UND INSERTION DES AAC IN DIE INNENMEMBRAN 86
3.2.1 MODULARE STRUKTUR DES AAC 86
3.2.2 IMPORT DER EINZELNEN MODULE DES AAC 87
3.2.3 INTERAKTION DES AAC AUF STUFE III MIT DEM TOM-KOMPLEX 92
3.2.4 CHARAKTERISIERUNG DES MEMBRANPOTENTIALABHAENGIGEN INSERTIONS- 94
SIGNALS DES AAC LIEGT IN MODUL 3
3.2.5 DER C-TERMINALE BEREICH DES AAC WIRD FUER DIE INSERTION IN DIE 96
INNENMEMBRAN BENOETIGT
3.2.6 INTERAKTION DER AAC-MODULE MIT TIMLO, TIML2 UND TIM22 97
3.2.7 INTERAKTION VON STUFE UEI-TRANSLOKATIONSINTERMEDIATEN DER 99
AAC-MODULE MIT TIMLO
3.2.8 WECHSELWIRKUNG DES AAC MIT DEM LOESLICHEN TIM9- 10-KOMPLEX 101
3.2.9 INTERAKTION VON STUFE III- INTERMEDIATEN MIT TIML2 104
3.2.10 DAS STUFE III-INTERMEDIAT DES AAC AKKUMULIERT AN KONTAKTSTELLEN
106
3.2.11 TOPOLOGIE DES AAC AUF STUFE III 107
3.2.12 DIE PROTEOLYTISCHEN FRAGMENTE DES AAC AUF STUFE III RESULTIEREN
110
AUS DER SPALTUNG EINES TRANSLOKATIONSINTERMEDIATS AN ALTERNATIVEN
SCHNITTSTELLEN
4. DISKUSSION 113
4.1 TIM9, TIMLO UND TIML2 SIND KOMPONENTEN DES TIM22-KOMPLEXES 113
4.1.1 TIM9, TIMLO UND TIML2 SIND MIT TIM22 IN EINEM KOMPLEX 113
ASSOZIIERT
4.1.2 TIM9, TIMLO UND TIML2 WERDEN FUER DEN IMPORT VON PROTEINEN MIT 114
INTERNEM SORTIERUNGSSIGNAL BENOETIGT
4.1.3 SEQUENTIELLE INTERAKTION VON TIM9, TIMLO UND TIML2 BEIM IMPORT 115
DES AAC IN DIE INNENMEMBRAN
4.1.4 DAS ZINKFINGER-MOTIV VON TIMLO UND TIML2 KOENNTE EINE ROLLE 116
BEIM PROTEINIMPORT VON PROTEINEN MIT INTERNEM SORTIERUNGSSIGNAL
SPIELEN
4.2 TRANSPORT DES ADP/ATP-CARRIERS VOM TOM-KOMPLEX ZUM TIM22- 119
KOMPLEX
4.2.1 JEDES MODUL DES AAC BESITZT EIN UNABHAENGIGES IMPORTSIGNAL 119
4.2.2 DIE INTERAKTION DES STUFE III-INTERMEDIATS DES AAC MIT DEM 120
TOM-KOMPLEX WIRD DURCH MODUL 3 VERMITTELT
4.2.3 MODUL 3 VERMITTELT DIE INSERTION DES AAC IN DIE INNENMEMBRAN 120
4.2.4 INTERAKTION VON TIM-KOMPONENTEN MIT STUFE IUE-TRANSLOKATIONS- 121
INTERMEDIATEN
4.2.5 AKKUMULATION DES AAC AN KONTAKTSTELLEN 122
4.2.6 TOPOLOGIE VON AAC-TRANSLOKATIONSINTERMEDIATEN 123
4.3 MODELL DES IMPORTS DES AAC 124
5. ZUSAMMENFASSUNG 128
6. LITERATUR
130 |
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