Expression, Renaturierung und Charakterisierung von menschlichem p53:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1
1 EINLEITUNG.4
1.1 EXPRESSION REKOMBINANT ERZEUGTER PROTEINE IN E.COLI. 4
1.1.1 EXPRESSIONSVEKTOREN UND -STAEMME.5
1.1.2 EXPRESSION ALS YYINCHISION BODIES".6
1.2 PROTEINFALTUNG
.8
1.2.1 PROTEINFALTUNG
IN VIVO.8
1.2.2 PROTEINFALTUNG IN VITRO.9
1.2.3 RENATURIERUNG VON YYINCLUSION BODY"-PROTEINEN.V.11
1.3 DAS TUMORSUPPRESSORPROTEIN
P53_.13
1.3.1 DIE P53-FAMILIE.14
1.3.2 STRUKTUR VON P53.15
1.3.3 FUNKTION UND REGULATION.22
1.3.4 KONFORMATIONELLE FLEXIBILITAET.33
1.3.5 FALTUNG UND STABILITAET.35
1.3.6 WECHSELWIRKUNG MIT CHAPERONEN.39
1.4 PROBLEMSTELLUNG. 43
2 MATERIAL UND METHODEN.45
2.1 VERWENDETES MATERIAL. 45
2.1.1 CHEMIKALIEN.45
2.1.2 ENZYME UND PROTEINE.46
2.1.3 ANTIKOERPER.46
2.1.4 STANDARDS UND KITS.46
2.1.5 MATERIALIEN FUER DIE CHROMATOGRAPHIE.47
2.1.6 WEITERE MATERIALIEN.47
2.1.7 BAKTERIENSTAEMME.47
2.1.8 PLASMIDE.48
2.1.9 OLIGODESOXYNUKLEOTIDE.49
2.1.10 ANTIBIOTIKA UND NAEHRMEDIEN (SAMBROOK ET CD., 1989).50
2.1.11 PUFFER UND LOESUNGEN.51
2.1.12 GERAETE.52
2.1.13 COMPUTERPROGRAMME.53
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.54
2.2.1 KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG VON . CO/I-STAEMMEN (SAMBROOK ET
AL., 1989).54
2.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI.54
2.2.3 PCR-AMPLIFIKATION (MULLIS & FALOONA, 1987).55
2.2.4 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN.56
2.2.5 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN UND DNA-FRAGMENTEN.56
2.2.6 ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON DNA. 56
2.2.7 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE (SAMBROOK ET AL., 1989).57
2.2.8 TRANSFORMATION VON E.COLI-ZELLEN.58
2.2.9 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA.58
2.2.10 FAELLUNG VON DNA.59
2.2.11 TEST AUF PLASMIDSTABILITAET.59
2.3 PRAEPARATIVE METHODEN. 59
2.3.1 ANALYSE DER PROTEINEXPRESSION.59
2.3.2 ANZUCHT UND INDUKTION.60
2.3.3 ZELLENDE UND AUFSCHLUSSMETHODEN.61
2.3.4 PRAEPARATION UND SOLUBILISIERUNG VON YYINCLUSION BODIES".61
2.3.5 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN.62
2.3.6 AUFKONZENTRIERUNG UND DIALYSE.64
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2
2.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN. 65
2.4.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).65
2.4.2 PROTEIN-NACHWEISMETHODEN.65
2.4.3 DENSITOMETRIE.66
2.4.4 LMMUNOBLOTTING (WESTERN BLOT).66
2.4.5 PROTEIN-SEQUENZBLOT.67
2.4.6 RENATURIERUNG VON P53.68
2.4.7 ANALYTISCHE PROTEINFALLUNGSMETHODEN.68
2.4.8 ANALYTISCHE GELFILTRATION DURCH HPLC. 69
2.4.9 QUERVEMETZUNG VON PROTEINEN.69
2.4.10 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATIOA.70
2.4.11 LMMUNOPRAEZIPITATION.*.70
2.4.12 BLUE NATIVE PAGE.71
2.5 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN.71
2.5.1 ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE.72
2.5.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE.73
2.5.3 CIRCULARDICHROISMUS (CD).74
2.5.4 LICHTSTREUUNG.75
2.5.5 LICHTTRUEBUNG.75
2.6 DNA-BINDUNGSASSAY (EMSA). 76
2.7 METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER STABILITAET VON PROTEINEN.- 76
2.8 LN VITRO TRANSLATION/TRANSKRIPTION VON
PROTEINEN.-78
2.8.1
LN VITRO TRANSLATION/TRANSKRIPTION IM RTS-SYSTEM.78
2.8.2 LN VITRO TRANSLATION/TRANSKRIPTION IM RETIKULOZYTENLYSAT.78
3 ERGEBNISSE.80
3.1 KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSPLASMIDE.80
3.2 EXPRESSIONSANALYSEN VON WT-P53.81
3.2.1 EXPRESSION IM GESAMTLYSAT.81
3.2.2 ANALYSE DER VERSCHIEDENEN ZELLFRAKTIONEN.83
3.2.3 EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE LOESLICHE EXPRESSION.83
3.2.4 EINFLUSS VON CHAPERONEN UND THIOREDOXIN.85
3.2.5 INDUKTIONSBEDINGUNGEN.86
3.2.6 EINFLUSS DES DNAY/A/GLZ-GENPRODUKTS.86
3.3 VERGLEICH VERSCHIEDENER AUFSCHLUSSMETHODEN.87
3.4 REINIGU
NGSANALYSEN UND OPTIMIERUNGEN.88
3.5 RENATURIERUNG VON WT-P53 AUS YYINCLUSION BODIES".
91
3.5.1 PRODUKTION ALS YYINCLUSION BODIES".
91
3.5.2 RENATURIERUNGSPROTOKOLL.9*
3.5.3 OPTIMIERUNG DES RENATURIERUNGSPUFFERS.93
3.5.4 EINFLUSS VON PH-WERT UND TEMPERATUR.99
3.5.5 AGGREGATION UND KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT.101
3.5.6 RENATURIERUNGSKINETIK UND PULSRENATURIERUNG.103
3.5.7 AUSBEUTEN UND QUANTIFIZIERUNG.105
3.5.8 REINIGUNG VON RENATURIERTEM P53.106
3.6 CHARAKTERISIERUNG VON RENATURIERTEM WT-P53.HO
3.6.1 ALLGEMEINE EIGENSCHAFTEN VON MENSCHLICHEM WT-P53.110
3.6.2 AKTIVITAET VON RENATURIERTEM P53.111
3.6.3 QUARTAERSTRUKTUR VON RENATURIERTEM P53.117
3.6.4 SPEKTROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON RENATURIERTEM P53.114
INHALTSVERZEICHNIS
3
3.6.5 KONFORMATION VON RENATURIERTEM P53.119
3.6.6 STABILITAET UND LAGERUNG VON RENATURIERTEM P53.120
3.7 EXPRESSION UND REINIGUNG VON HIS-P53. 122
3.8 EXPRESSION UND REINIGUNG VON N93P53. 125
3.9 CHARAKTERISIERUNG VON WT-P53 UND N93P53. 128
3.9.1 ALLGEMEINE EIGENSCHAFTEN VON MENSCHLICHEM N93P53 UND
WT-HIS-P53.128
3.9.2 AKTIVITAET.128
3.9.3 QUARTAERSTRUKTUR.129
3.9.4 SPEKTROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG.S.131
3.9.5 KONFORMATION.136
3.9.6 STABILITAET GEGEN DENATURIERUNG.137
3.10 P53 UND SEINE WECHSELWIRKUNG MIT CHAPERONEN.141
3.10.1 RENATURIERUNG VON P53 MIT CHAPERONEN.142
3.10.2 EXPRESSION IM .CO/F-LYSAT (RTS-SYSTEM).142
3.10.3 EXPRESSION IM RETIKULOZYTEN-LYSAT.145
4 DISKUSSION. 148
4.1 REKOMBINANTE EXPRESSION VON P53.148
4.1.1 EXPRESSION IN E.COLI.148
4.1.2 EXPRESSION IN IN VITRO-SYSTEMEN.:.149
4.2 RENATURIERUNG VON
P53.-.-.-.-.150
4.3 CHARAKTERISIERUNG VON RENATURIERTEM P53, WT-P53 UND
N93P53. 153
5 ZUSAMMENFASSUNG.162
6 LITERATURVERZEICHNIS.164
7 ABKUERZUNGEN
176 |
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