Holdings: Plastidentransformation bei Nicotiana tabacum

Plastidentransformation bei Nicotiana tabacum: Mutation der plastidenkodierten RNA-Polymerase, der plastidären Leseraster ycf4-ycf5 : neue Selektionsmarker

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Main Author:	De Santis-Maciossek, Giovanna (Author)
Format:	Book
Language:	German
Published:	2000
Subjects:	Transformation > Genetik Tabak Plastide Hochschulschrift
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adam_text	INHALT I INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGEN 1 EINLEITUNG 1.1 PLASTIDEN -------------------------------------------------------------------------------- 1 1.2 DAS PLASTIDAERE GENOM --------------------------------------------------------------- 2 1.3 DIE GENEXPRESSION IN PLASTIDEN --------------------------------------------------- 8 1.3.1 DIE TRANSKRIPTION IN PLASTIDEN ------------------------------------------ 8 1.3.2 PROZESSIERUNG, STABILITAET UND ABBAU PLASTIDAERER RNA -------------- 11 1.3.3 DIE PLASTIDAERE TRANSLATION ----------------------------------------------- 12 1.4 PLASTIDENTRANSFORMATION ------------------------------------------------------------ 13 1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ------------------------------------------------------------- 16 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 CHEMIKALIEN -------------------------------------------------------------------------- 17 2.2 BAKTERIENSTAEMME ------------------------------------------------------------------- 18 2.3 NAEHRMEDIEN FUER BAKTERIEN -------------------------------------------------------- 18 2.4 PHAGENSTAEMME ----------------------------------------------------------------------- 18 2.5 ENZYME & KITS ---------------------------------------------------------------------- 19 2.5.1 RESTRIKTIONSENZYME ----------------------------------------------------------------- 19 2.5.2 WEITERE ENZYME ------------------------------------------------------------ 19 2.5.3 " KITS " ------------------------------------------------------------------------ 19 2.6 GROESSENMARKER ----------------------------------------------------------------------- 19 2.6.1 DNA-MARKER --------------------------------------------------------------- 19 2.6.2 PROTEIN-MARKER ------------------------------------------------------------- 19 2.7 OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE ------------------------------------------------------- 20 2.8 PLASMIDE 20 2.9 ANTIKOERPER ---------------------------------------------------------------------------- 24 2.10 PFLANZENMATERIAL -------------------------------------------------------------------- 24 2.11 ANZUCHTBEDINGUNGEN --------------------------------------------------------------- 24 2.12 ISOLIERUNG VON GESAMT-NUKLEINSAEURE ------------------------------------------- 24 2.12.1 ISOLIERUNG VON PFLANZLICHER DNA ------------------------------------- 24 2.12.2 ISOLIERUNG VON PFLANZLICHER RNA ------------------------------------- 25 2.12.2.1 PRAEPARATION VON RNA MIT "TRIZOLYY REAGENZ " --------- 25 2.13 PLASMIDPRAEPARATION ----------------------------------------------------------------- 25 2.13.1 PLASMID-MINIPRAEPARATION ----------------------------------------------- 25 INHALT II 2.13.2 PLASMIDPRAEPARATION MIT ANIONENAUSTAUSCHERSAEULEN -------------- 26 2.14 FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN ------------------------------------------------------- 26 2.14.1 ETHANOL-FAELLUNG ----------------------------------------------------------- 26 2.15 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREN (PHOTOMETER) ------------- 26 2.16 GELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN ----------------------------------------- 26 2.16.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA ------------------------------ 26 2.16.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON RNA ------------------------------ 27 2.17 FAERBUNG VON NUKLEINSAEUREN ------------------------------------------------------ 27 2.17.1 ETHIDIUMBROMID-FAERBUNG VON DNA --------------------------------- 27 2.17.2 METHYLENBLAU-FAERBUNG VON RNA ------------------------------------- 27 2.18 REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN ---------------------------------------------------- 28 2.18.1 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION ---------------------------------------- 2 8 2.18.2 CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL-EXTRAKTION ----------------------------- 28 2.18.3 DNA-REINIGUNG AUS AGAROSE-GELEN MIT QIAEXII ------------- 28 2.19 SPALTUNG VON NUKLEINSAEUREN ------------------------------------------------------ 28 2.19.1 SPALTUNG MIT RNASEA --------------------------------------------------- 28 2.19.2 SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENZYMEN ----------------------------------- 28 2.20 AUFFUELLEN 3 ' -ZURUECKGESETZTER ENDEN VON DSDNA MIT KLENOW-FRAGMENT ------------------------------------------------------------------ 28 2.21 KLONIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN ---------------------------------------------- 29 2.22 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN ------------------------------------------------- 29 2.23 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ---------------------------------------------- 29 2.24 REVERSE TRANSKRIPTION ------------------------------------------------------------- 29 2.25 KAPILLARTRANSFER VON NUKLEINSAEUREN -------------------------------------------- 30 2.25.1 KAPILLARTRANSFER VON DNA AUF NYLONMEMBRAN ( " SOUTHERN -ANALYSE " ) ----------------------------------------- 30 2.25.2 KAPILLARTRANSFER VON RNA AUF NYLONMEMBRAN ( " NORTHERN-ANALYSE " ) ------------------------------------------ 30 2.26 MARKIERUNG VON NUKLEINSAEUREN -------------------------------------------------- 31 2.26.1 MARKIERUNG VON DNA --------------------------------------------------- 31 2.27 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION --------------------------------------------------- 31 2.27.1 HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN DNA-FRAGMENTEN - 31 2.28 KOMPETENTE BAKTERIENZELLEN (SAMBROOCK ET AL., 1989) ---------------------- 32 2.29 TRANSFORMATION KOMPETENTER A.CO/I-ZELLEN (SAMBROOCK ET AL., 1989) --------------------------------------------------------- 32 2.30 IN VI/RO-MUTAGENESE ---------------------------------------------------------------- 32 2.31 TRANSFORMATION VON PLASTIDEN VON NICOTIANA TABACUM --------------------- 35 2.31.1 STERILISIERUNG VON SAMEN ----------------------------------------------- 35 2.31.2 MEDIEN FUER DIE GEWEBEKULTUR ----------------------------------------- 35 INHALT ID 2.31.3 PEG-TRANSFORMATION VON PFLANZENZELLEN (KOOP UND KOFER 1995)--------------------------------------------------------------- 36 2.31.3.1 ISOLIERUNG VON PROTOPLASTEN AUS TABAKBLAETTERN --------- 37 2.31.3.2 TRANSFORMATION VON PROTOPLASTEN MIT PEG (KOOP UND KOFER 1995) --------------------------------- 38 2.31.3.3 EINBETTEN VON PROTOPLASTEN IN ALGINAT-NETZE (KOFER ET AL., 1998) ------------------------------- 38 2.31.4 " BIOLISTISCHE " TRANSFORMATION VON PFLANZENZELLEN (BRUNNER 1997) -------------------------------------------------- 39 2.31.4.1 VORBEREITUNG UND DNA-BESCHICHTUNG DER GOLDPARTIKEL ------ 39 2.31.4.2 BIOLISTISCHER BESCHUSS VON TABAKBLAETTERN ---------------- 40 2.31.5 SELEKTION TRANSPLASTOMISCHER PFLANZENLINIEN ------------------------ 41 2.32 ISOLIERUNG VON POLYSOMALER RNA ----------------------------------------------- 42 2.33 PRAEPARATION VON PROTEINEXTRAKT AUS BLAETTERN ----------------------------------- 43 2.33.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN AUS GESAMT PROTEINEXTRAKTEN - - - - - - - - - - - - - - - - - - 44 2.34 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE ---------------------------------------- 44 2.34.1 SDS-PAGE NACH LAENUNLI (1970) -------------------------------------- 44 2.34.2 PONCEAU-S FAERBUNG VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSE MEMBRAN ---------------------------------------------------------- 45 2.34.3 ELEKTROTRANSFER VON POLYPEPTIDEN AUF NITROZELLULOSEMEMBRANEN ------------------------------------ 46 2.34.4 INUNUNODETEKTION DES IMMOBILISIERTEN ANTIGENS ------------------- 46 2.35 PIGMENTANALYSE ---------------------------------------------------------------------- 47 2.35.1 UV/VIS-SPEKTROSKOPIE -------------------------------------------------- 47 2.35.2 HPLC-ANALYSE ------------------------------------------------------------ 47 2.35.3 ALA-INKUBATION UND PIGMENTEXTRAKTION ---------------------------- 48 2.36 ELEKTRONENMIKROSKOPIE ------------------------------------------------------------ 48 2.37 CHLOROPHYLL-FLUORESZENZ-MESSUNG ---------------------------------------------- 49 2.38 PULSMARKIERUNG (MUELLER, B. UND EICHACKER, L.A. 1999) ------------------- 50 3 ERGEBNISSE 3.1 INSERTIONSINAKTIVIERUNG DER PLASTIDAEREN RNA-POLYMERASE IN NICOTIANA TABACUM ----------------------------------------------------------------- 51 3.1.1 PLASTIDENTRANSFORMATION VON NICOTIANA TABACUM MITTELS PEG-METHODE UND SELEKTION DER TRANSFORMIERTEN LINIEN: RPRR-PHAENOTYP ----------------------------------------------------- 52 3.1.2 MOLEKULARE UEBERPRUEFUNG DER TRANSFORMIERTEN LINIEN ------------- 54 INHALT IV 3.1.3 CHARAKTERISIERUNG DER RPO MUTANTEN ------------------------------- 56 3.1.3.1 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE STUDIEN ZUR STRUKTUR DER MUTIERTEN PLASTIDEN ------------------------------- 56 3.1.3.2 IMMUNOLOGISCHE ANALYSE KERN UND PLASTIDAER KODIERTER PROTEINE IN RPO--PFLANZEN ---------------------------- 58 3.1.3.3 NORTHERN-ANALYSE, PROZESSIERUNG DER TRANS KRIPTE, RIBOSOMEN UND RIBOSOMALE AKTIVITAET ----- 60 3.1.3.4 PIGMENT-ANALYSE ----------------------------------------------- 65 3.2 FUNKTIONSANALYSE DER OFFENEN LESERASTER ORF184 (YCFT) UND ORF313 (YCSS) IN NICOTIANA TABACUM ------------------------------- 67 3.2.1 IN VRTRO-MUTAGENESE DER NICOTIANA TABACUM YCFL UND YC/5-SEQUENZEN -------------------------------------------------- 67 3.2.2 "PARTICLE GURI ' -TRANSFORMATION VON NICOTIANA TABACUM ------------------------------------ 68 3.2.3 UEBERPRUEFUNG DER INTEGRATION INS PLASTIDENGENOM ----------------- 69 3.2.4 CHARAKTERISIERUNG DER YC/4 UND YC^-PLASTIDENTRANSFOR MANTEN ------------------------------------------------------------ 71 3.2.4.1 MESSUNG DER CHLOROPHYLLFLUORESZENZ IN DENYC/4 UND ^C/5-TRANSFORMANTEN --------------------------- 71 3.2.4.2 NORTHERN ANALYSE DERYE/4'-UNDY Y5~-LINIEN -------------- 72 3.3 ALTERNATIVE SELEKTIONSMARKER ZUR PLASTOMTRANSFORMATION VON NICOTIA NA TABACUM: HYGROMYCIN-B-PHOSPHOTRANSFERASE UND PHOSPHINOTRI CIN-N-ACETYLTRANSFERASE ------------------------------------------------- 74 3.3.1 PHPH/AADN UND PB477AARIA-PLASMIDE ------------------------------ 74 3.3.2 TRANSFORMATION VON NICOTIANA TABACUM MIT DEN NEUEN SELEKTIONSKASSETTEN UND SELEKTION -------------------------- 75 3.3.3 CHARAKTERISIERUNG DER HPH UND P^T-RESISTENTEN LINIEN ---------- 75 3.3.4 ANALYSE DER PLASTIDENTRANSFORMANTEN ZUM RESISTENZ VERHALTEN BEI HOHEN KONZENTRATIONEN VON HYGROMYCIN BZW. BIALAPHOS -------------------------------------------------- 77 4 DISKUSSION 4.1 MUTATION DER PLASTIDAEREN RPON-, RPOSS UND RPOC 1 -GENE IN NICOTIANA TABACUM ------------------------------------------------------- 80 4.2 CHARAKTERISIERUNG DES PHAENOTYPS DER RPO--PSS.ANZEN ------------------------ 80 4.2.1 WACHSTUMSVERHALTEN UND DER ASPEKT DER HOMOPLASTOMIE IN DEN RPO--PFLANZEN ----------------------------------------------- 80 INHALT V 4.2.2 ULTRASTRUKTUR DER RPO--PLASTIDEN ---------------------------------------- 81 4.2.3 PIGMENTZUSAMMENSETZUNG IN RPO-PFLANZEN ------------------------ 82 4.2.4 TRANSKRIPTIONS UND TRANSLATIONSMASCHINERIE IN ZPO'-MUTANTEN ------------------------------------------------------------ 83 4.3 INAKTIVIERUNG DER GENE YCFOE UND YCFI IN NICOTIANA TABACUM ------------ 87 4.4 HYGROMYCIN-B-PHOSPHOTRANSFERASE UND PHOSPHINOTRICIN N-ACETYLTRANSFERASE ALS POTENZIELLE SELEKTIONSMARKER FUER DIE PLASTIDEN TRANSFORMATION IN NICOTIANA TABACUM ----------------------------------------- 89 4.4.1 TRANSFORMATION MIT DEN NEUEN MARKERKASSETTEN ------------------- 89 4.4.2 HYGROMYCIN-B-PHOSPHOTRANSFERASE UND PHOSPHINOTRICIN N-ACETYLTRANSFERASE ALS SELEKTIONSMARKER IN TABAK --------------- 90 5 ZUSAMMENFASSUNG ---------------------------------------------------------- 92 6 LITERATURVERZEICHNIS -------------------------------------------------------- 94 7 LEBENSLAUF ------------------------------------------------------------------- 110 8 PUBLIKATIONEN ---------------------------------------------------------------- 111 9 DANKSAGUNG ----------------------------------------------------------------- 112
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