Plastidentransformation bei Nicotiana tabacum: Mutation der plastidenkodierten RNA-Polymerase, der plastidären Leseraster ycf4-ycf5 : neue Selektionsmarker
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2000 |
| Beschreibung: | VII, 113 S. Ill. |
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INHALT
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
EINLEITUNG
1.1
PLASTIDEN
--------------------------------------------------------------------------------
1
1.2
DAS
PLASTIDAERE
GENOM
---------------------------------------------------------------
2
1.3
DIE
GENEXPRESSION
IN
PLASTIDEN
---------------------------------------------------
8
1.3.1
DIE
TRANSKRIPTION
IN
PLASTIDEN
------------------------------------------
8
1.3.2
PROZESSIERUNG,
STABILITAET
UND
ABBAU
PLASTIDAERER
RNA
--------------
11
1.3.3
DIE
PLASTIDAERE
TRANSLATION
-----------------------------------------------
12
1.4
PLASTIDENTRANSFORMATION
------------------------------------------------------------
13
1.5
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
-------------------------------------------------------------
16
2
MATERIAL
UND
METHODEN
2.1
CHEMIKALIEN
--------------------------------------------------------------------------
17
2.2
BAKTERIENSTAEMME
-------------------------------------------------------------------
18
2.3
NAEHRMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
--------------------------------------------------------
18
2.4
PHAGENSTAEMME
-----------------------------------------------------------------------
18
2.5
ENZYME
&
KITS
----------------------------------------------------------------------
19
2.5.1
RESTRIKTIONSENZYME
-----------------------------------------------------------------
19
2.5.2
WEITERE
ENZYME
------------------------------------------------------------
19
2.5.3
"
KITS
"
------------------------------------------------------------------------
19
2.6
GROESSENMARKER
-----------------------------------------------------------------------
19
2.6.1
DNA-MARKER
---------------------------------------------------------------
19
2.6.2
PROTEIN-MARKER
-------------------------------------------------------------
19
2.7
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
-------------------------------------------------------
20
2.8
PLASMIDE
20
2.9
ANTIKOERPER
----------------------------------------------------------------------------
24
2.10
PFLANZENMATERIAL
--------------------------------------------------------------------
24
2.11
ANZUCHTBEDINGUNGEN
---------------------------------------------------------------
24
2.12
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-NUKLEINSAEURE
-------------------------------------------
24
2.12.1
ISOLIERUNG
VON
PFLANZLICHER
DNA
-------------------------------------
24
2.12.2
ISOLIERUNG
VON
PFLANZLICHER
RNA
-------------------------------------
25
2.12.2.1
PRAEPARATION
VON
RNA
MIT
"TRIZOLYY
REAGENZ
"
---------
25
2.13
PLASMIDPRAEPARATION
-----------------------------------------------------------------
25
2.13.1
PLASMID-MINIPRAEPARATION
-----------------------------------------------
25
INHALT
II
2.13.2
PLASMIDPRAEPARATION
MIT
ANIONENAUSTAUSCHERSAEULEN
--------------
26
2.14
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
-------------------------------------------------------
26
2.14.1
ETHANOL-FAELLUNG
-----------------------------------------------------------
26
2.15
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER
NUKLEINSAEUREN
(PHOTOMETER)
-------------
26
2.16
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
-----------------------------------------
26
2.16.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
------------------------------
26
2.16.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
------------------------------
27
2.17
FAERBUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
------------------------------------------------------
27
2.17.1
ETHIDIUMBROMID-FAERBUNG
VON
DNA
---------------------------------
27
2.17.2
METHYLENBLAU-FAERBUNG
VON
RNA
-------------------------------------
27
2.18
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
----------------------------------------------------
28
2.18.1
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
----------------------------------------
2
8
2.18.2
CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL-EXTRAKTION
-----------------------------
28
2.18.3
DNA-REINIGUNG
AUS
AGAROSE-GELEN
MIT
QIAEXII
-------------
28
2.19
SPALTUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
------------------------------------------------------
28
2.19.1
SPALTUNG
MIT
RNASEA
---------------------------------------------------
28
2.19.2
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
-----------------------------------
28
2.20
AUFFUELLEN
3
'
-ZURUECKGESETZTER
ENDEN
VON
DSDNA
MIT
KLENOW-FRAGMENT
------------------------------------------------------------------
28
2.21
KLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
----------------------------------------------
29
2.22
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
-------------------------------------------------
29
2.23
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
----------------------------------------------
29
2.24
REVERSE
TRANSKRIPTION
-------------------------------------------------------------
29
2.25
KAPILLARTRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
--------------------------------------------
30
2.25.1
KAPILLARTRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRAN
(
"
SOUTHERN
-ANALYSE
"
)
-----------------------------------------
30
2.25.2
KAPILLARTRANSFER
VON
RNA
AUF
NYLONMEMBRAN
(
"
NORTHERN-ANALYSE
"
)
------------------------------------------
30
2.26
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
--------------------------------------------------
31
2.26.1
MARKIERUNG
VON
DNA
---------------------------------------------------
31
2.27
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
---------------------------------------------------
31
2.27.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
-
31
2.28
KOMPETENTE
BAKTERIENZELLEN
(SAMBROOCK
ET
AL.,
1989)
----------------------
32
2.29
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
A.CO/I-ZELLEN
(SAMBROOCK
ET
AL.,
1989)
---------------------------------------------------------
32
2.30
IN
VI/RO-MUTAGENESE
----------------------------------------------------------------
32
2.31
TRANSFORMATION
VON
PLASTIDEN
VON
NICOTIANA
TABACUM
---------------------
35
2.31.1
STERILISIERUNG
VON
SAMEN
-----------------------------------------------
35
2.31.2
MEDIEN
FUER
DIE
GEWEBEKULTUR
-----------------------------------------
35
INHALT
ID
2.31.3
PEG-TRANSFORMATION
VON
PFLANZENZELLEN
(KOOP
UND
KOFER
1995)---------------------------------------------------------------
36
2.31.3.1
ISOLIERUNG
VON
PROTOPLASTEN
AUS
TABAKBLAETTERN
---------
37
2.31.3.2
TRANSFORMATION
VON
PROTOPLASTEN
MIT
PEG
(KOOP
UND
KOFER
1995)
---------------------------------
38
2.31.3.3
EINBETTEN
VON
PROTOPLASTEN
IN
ALGINAT-NETZE
(KOFER
ET
AL.,
1998)
-------------------------------
38
2.31.4
"
BIOLISTISCHE
"
TRANSFORMATION
VON
PFLANZENZELLEN
(BRUNNER
1997)
--------------------------------------------------
39
2.31.4.1
VORBEREITUNG
UND
DNA-BESCHICHTUNG
DER
GOLDPARTIKEL
------
39
2.31.4.2
BIOLISTISCHER
BESCHUSS
VON
TABAKBLAETTERN
----------------
40
2.31.5
SELEKTION
TRANSPLASTOMISCHER
PFLANZENLINIEN
------------------------
41
2.32
ISOLIERUNG
VON
POLYSOMALER
RNA
-----------------------------------------------
42
2.33
PRAEPARATION
VON
PROTEINEXTRAKT
AUS
BLAETTERN
-----------------------------------
43
2.33.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
AUS
GESAMT
PROTEINEXTRAKTEN
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
44
2.34
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
----------------------------------------
44
2.34.1
SDS-PAGE
NACH
LAENUNLI
(1970)
--------------------------------------
44
2.34.2
PONCEAU-S
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
MEMBRAN
----------------------------------------------------------
45
2.34.3
ELEKTROTRANSFER
VON
POLYPEPTIDEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
------------------------------------
46
2.34.4
INUNUNODETEKTION
DES
IMMOBILISIERTEN
ANTIGENS
-------------------
46
2.35
PIGMENTANALYSE
----------------------------------------------------------------------
47
2.35.1
UV/VIS-SPEKTROSKOPIE
--------------------------------------------------
47
2.35.2
HPLC-ANALYSE
------------------------------------------------------------
47
2.35.3
ALA-INKUBATION
UND
PIGMENTEXTRAKTION
----------------------------
48
2.36
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
------------------------------------------------------------
48
2.37
CHLOROPHYLL-FLUORESZENZ-MESSUNG
----------------------------------------------
49
2.38
PULSMARKIERUNG
(MUELLER,
B.
UND
EICHACKER,
L.A.
1999)
-------------------
50
3
ERGEBNISSE
3.1
INSERTIONSINAKTIVIERUNG
DER
PLASTIDAEREN
RNA-POLYMERASE
IN
NICOTIANA
TABACUM
-----------------------------------------------------------------
51
3.1.1
PLASTIDENTRANSFORMATION
VON
NICOTIANA
TABACUM
MITTELS
PEG-METHODE
UND
SELEKTION
DER
TRANSFORMIERTEN
LINIEN:
RPRR-PHAENOTYP
-----------------------------------------------------
52
3.1.2
MOLEKULARE
UEBERPRUEFUNG
DER
TRANSFORMIERTEN
LINIEN
-------------
54
INHALT
IV
3.1.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
RPO
MUTANTEN
-------------------------------
56
3.1.3.1
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
STUDIEN
ZUR
STRUKTUR
DER
MUTIERTEN
PLASTIDEN
-------------------------------
56
3.1.3.2
IMMUNOLOGISCHE
ANALYSE
KERN
UND
PLASTIDAER
KODIERTER
PROTEINE
IN
RPO--PFLANZEN
----------------------------
58
3.1.3.3
NORTHERN-ANALYSE,
PROZESSIERUNG
DER
TRANS
KRIPTE,
RIBOSOMEN
UND
RIBOSOMALE
AKTIVITAET
-----
60
3.1.3.4
PIGMENT-ANALYSE
-----------------------------------------------
65
3.2
FUNKTIONSANALYSE
DER
OFFENEN
LESERASTER
ORF184
(YCFT)
UND
ORF313
(YCSS)
IN
NICOTIANA TABACUM
-------------------------------
67
3.2.1
IN
VRTRO-MUTAGENESE
DER
NICOTIANA
TABACUM
YCFL
UND
YC/5-SEQUENZEN
--------------------------------------------------
67
3.2.2
"PARTICLE
GURI
'
-TRANSFORMATION
VON
NICOTIANA
TABACUM
------------------------------------
68
3.2.3
UEBERPRUEFUNG
DER
INTEGRATION
INS
PLASTIDENGENOM
-----------------
69
3.2.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
YC/4
UND
YC^-PLASTIDENTRANSFOR
MANTEN
------------------------------------------------------------
71
3.2.4.1
MESSUNG
DER
CHLOROPHYLLFLUORESZENZ
IN
DENYC/4
UND
^C/5-TRANSFORMANTEN
---------------------------
71
3.2.4.2
NORTHERN
ANALYSE
DERYE/4'-UNDY Y5~-LINIEN
--------------
72
3.3
ALTERNATIVE
SELEKTIONSMARKER
ZUR
PLASTOMTRANSFORMATION
VON
NICOTIA
NA
TABACUM:
HYGROMYCIN-B-PHOSPHOTRANSFERASE
UND
PHOSPHINOTRI
CIN-N-ACETYLTRANSFERASE
-------------------------------------------------
74
3.3.1
PHPH/AADN
UND
PB477AARIA-PLASMIDE
------------------------------
74
3.3.2
TRANSFORMATION
VON
NICOTIANA
TABACUM
MIT
DEN
NEUEN
SELEKTIONSKASSETTEN
UND
SELEKTION
--------------------------
75
3.3.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
HPH
UND
P^T-RESISTENTEN
LINIEN
----------
75
3.3.4
ANALYSE
DER
PLASTIDENTRANSFORMANTEN
ZUM
RESISTENZ
VERHALTEN
BEI
HOHEN
KONZENTRATIONEN
VON
HYGROMYCIN
BZW.
BIALAPHOS
--------------------------------------------------
77
4
DISKUSSION
4.1
MUTATION
DER
PLASTIDAEREN RPON-,
RPOSS
UND
RPOC
1
-GENE
IN
NICOTIANA
TABACUM
-------------------------------------------------------
80
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
PHAENOTYPS
DER
RPO--PSS.ANZEN
------------------------
80
4.2.1
WACHSTUMSVERHALTEN
UND
DER
ASPEKT
DER
HOMOPLASTOMIE
IN
DEN
RPO--PFLANZEN
-----------------------------------------------
80
INHALT
V
4.2.2
ULTRASTRUKTUR
DER
RPO--PLASTIDEN
----------------------------------------
81
4.2.3
PIGMENTZUSAMMENSETZUNG
IN
RPO-PFLANZEN
------------------------
82
4.2.4
TRANSKRIPTIONS
UND
TRANSLATIONSMASCHINERIE
IN
ZPO'-MUTANTEN
------------------------------------------------------------
83
4.3
INAKTIVIERUNG
DER
GENE
YCFOE
UND
YCFI
IN
NICOTIANA TABACUM
------------
87
4.4
HYGROMYCIN-B-PHOSPHOTRANSFERASE
UND
PHOSPHINOTRICIN
N-ACETYLTRANSFERASE
ALS
POTENZIELLE
SELEKTIONSMARKER
FUER
DIE
PLASTIDEN
TRANSFORMATION
IN
NICOTIANA
TABACUM
-----------------------------------------
89
4.4.1
TRANSFORMATION
MIT
DEN
NEUEN
MARKERKASSETTEN
-------------------
89
4.4.2
HYGROMYCIN-B-PHOSPHOTRANSFERASE
UND
PHOSPHINOTRICIN
N-ACETYLTRANSFERASE
ALS
SELEKTIONSMARKER
IN
TABAK
---------------
90
5
ZUSAMMENFASSUNG
----------------------------------------------------------
92
6
LITERATURVERZEICHNIS
--------------------------------------------------------
94
7
LEBENSLAUF
-------------------------------------------------------------------
110
8
PUBLIKATIONEN
----------------------------------------------------------------
111
9
DANKSAGUNG
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| author | De Santis-Maciossek, Giovanna |
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